雌二醇对人幼稚型精原干细胞增殖活性影响机制的初步探讨

论文摘要

目的与意义:幼稚型精原干细胞是一种同时具有能够分化成为精子,或转化成为具有多能干细胞能力的一种特殊的干细胞,其在体内体外发生和凋亡的调节机制至今仍鲜有研究报道。在体内发育过程中,睾丸支持细胞（Sertoli cell）是唯一在发育全过程与精原干细胞接触的细胞,并以其独特的结构和功能为精子发生提供适宜的微环境,其中Sertoli细胞分泌的SCF是调节精原干细胞增殖、抗凋亡的关键因子,而Sertoli细胞对精原干细胞的调节作用受到激素、细胞因子等许多复杂因素的影响。本研究拟将人胚胎Sertoli细胞作为研究主体,建立体外分离、纯化和培养人胚胎Sertoli细胞的体系;在此基础上,观察不同浓度和不同作用时间雌二醇（β-estradiol）对人胚胎Sertoli细胞分泌干细胞因子（SCF）功能的调节;同时,研究雌二醇作用于人胚胎Sertoli细胞与幼稚型精原干细胞共培养体系,从细胞和分子水平观察雌二醇通过人胚胎Sertoli细胞对人幼稚型精原干细胞体外培养的调节。材料与方法:第一部分建立体外培养人胚胎Sertoli细胞体系:分离人胚胎Sertoli细胞,采用两步酶消化法及自然去除生殖细胞的纯化方法,对人胚胎Sertoli细胞进行接种与培养传代至12代,并对传代培养的纯化Sertoli细胞进行形态学,细胞标记物及功能检测,以证实培养细胞为具有生物学功能的Sertoli细胞;第二部分检测雌二醇对人胚胎Sertoli细胞体外表达SCF的调节:通过RT-PCR及细胞免疫荧光染色对人胚胎Sertoli细胞进行雌激素受体（ER）检测,并采用Realtime-PCR检测在不同浓度雌二醇及其不同作用时间,对人胚胎Sertoli细胞SCF基因表达的调节,并用细胞免疫荧光检测雌二醇调节人胚胎Sertoli细胞SCF蛋白表达的能力;第三部分雌二醇对人幼稚型精原干细胞体外扩增的调节:在人胚胎Sertoli细胞与人幼稚型精原干细胞体外共培养体系中,对培养所得细胞进行生殖细胞标记物和多能性标记物检测,通过5-溴,2’-脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）整合实验,检测雌二醇在共培养体系中对人幼稚型精原干细胞体外增殖的调节,用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）对雌二醇在人幼稚型精原干细胞凋亡过程中的作用进行初步研究。结果:首先,检测体外培养的人胚胎Sertoli细胞的分子标记为MIS+/c-Kit-/AP-,证明为纯化的人胚胎Sertoli细胞;实验结果显示,浓度为100ng/ml的雌二醇对人胚胎Sertoli细胞的SCF产生有显著促进作用,且这种作用在15min起效,在1h达到高峰并继续维持。雌二醇也能促进SCF蛋白表达增高。体外建立人胚胎Sertoli细胞与人幼稚型精原干细胞共培养体系,培养所得精原干细胞经标记物检测为c-Kit+/SSEA-4+/Oct-4+,证实其为具有多能性的幼稚型精原干细胞。在培养基中添加适宜浓度的雌二醇能诱导人胚胎Sertoli细胞产生SCF,与未添加雌二醇组比较,添加雌二醇组幼稚型精原干细胞BrdU整合阳性率显著提高,证实雌二醇对间接提高幼稚型精原干细胞增殖能力有显著促进作用;而且添加雌二醇组与未添加组及雌二醇与ER拮抗剂（ICI 182780）共同添加组比较,TUNEL整合率显著下降,提示雌二醇能间接抑制幼稚型精原干细胞凋亡。结论:本课题在细胞和分子水平上探讨了雌二醇对人幼稚型精原干细胞增殖活性的影响机制。结果表明,本研究建立了稳定的体外纯化,培养及传代人胚胎Sertoli细胞的体系;首次证实雌二醇能促进人胚胎Sertoli细胞表达SCF,具有剂量及时间依赖性;从细胞水平初步阐明了雌二醇通过调节SCF的产生间接调节人幼稚型精原干细胞增殖及凋亡的机制。也为进一步探讨人精原干细胞在体内的发育过程及增殖调控因素奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要英文缩略语索引
• 实验技术路线图
• 前言
• 第一章 人胚胎Sertoli细胞的体外长期培养及鉴定
• 1 材料与方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 第二章 E2调节人胚胎Sertoli细胞体外SCF表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三章 E2调节人幼稚型精原干细胞体外扩增
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果