论文摘要
目的:建立供者异体反应性NK细胞（Allo-NK）为预处理的非清髓性单倍相合造血干细胞移植（haplo-HSCT）的动物模型,探讨Allo-NK诱导移植早期供者免疫耐受和抑制移植后肺癌复发的作用机制。方法:以近交系C57BL/6J（H-2Db）雌鼠为受鼠,以C57BL/6J×BALB/c杂交F1代(H-2Db/d)雌鼠为供鼠,以氟达拉宾与环磷酰胺联合供者来源Allo-NK作为移植前的非清髓预处理方案,建立小鼠单倍相合造血干细胞移植模型。利用高强度磁珠分选系统纯化Allo-NK细胞亚群,流式细胞仪检测其中Ly49C+、Ly49A+细胞的比例,LDH法检测其对供者淋巴细胞的异体反应性和对Yac-1淋巴瘤和LLC肺癌细胞的杀伤活性。比较清髓性方案（9gyTBI）、各种非清髓性方案（6.5gyTBI,化疗组,Auto-NK+化疗组及Allo-NK+化疗组）的体内清髓效果,移植后不同时间点骨髓和脾脏的供者嵌合率,GVHD的发生率及严重程度。建立小鼠移植后肺癌复发模型,采用放射性标记法追踪DLI的体内分布。比较不同处理组小鼠的肿瘤大小,淋巴细胞浸润程度,采用RayBio?小鼠细胞因子芯片检测血清中22种细胞因子的变化。MTT法检测化疗组和Allo-NK+化疗组移植后不同时间点供受者混合淋巴细胞增殖反应（MLR）。并以灭活的供者淋巴细胞作为刺激细胞,正常C57BL/6小鼠和F1免疫C57BL/6小鼠的淋巴细胞作为效应细胞,分别加入不同浓度化疗组和Allo-NK+化疗组移植后23d的CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞行单向混合淋巴细胞培养,MTT法检测MLR强度,EHSA法检测培养上清中供者特异性IFN-γ的分泌量。流式细胞法比较化疗组和Allo-NK+化疗组移植后23d的脾脏CD4+CD25+CD127-调节性T细胞（Treg）比例;用荧光定量PCR法检测两组脾脏和胸腺CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞中IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β、IFN-γ、FoxP3的mRNA表达水平。分选化疗组和Allo-NK+化疗组移植后14d的胸腺CD11c+DC细胞,流式细胞法检测其成熟度,将其与正常C57BL/6小鼠的脾脏纯化CD3+T细胞体外共孵育5d,收集细胞,流式细胞法检测CD4+CD25+CD127-Treg比例,ELISA法检测其对供者特异性IFN-γ释放的影响,荧光定量PCR法和RayBio?小鼠细胞因子芯片检测Foxp3和多种细胞因子表达。结果:经过磁珠分选后,Allo-NK细胞纯度从（19.85±4.27）%上升至（74.63±5.49）%,活率超过95%,其中特异性识别并杀伤C57BL/6细胞的Ly49A+细胞占（22.24±2.95）%。效靶比为20:1时,Allo-NK对Yac-1、LLC和C57B L/6小鼠细胞的杀伤率分别为（62.27±7.36）%,（59.86±6.24）%和（54.83±5.26）%。与其他非清髓性预处理方案,如6.5GyTBI组、化疗组和Auto-NK+化疗组相比,Allo-NK+化疗组不仅对骨髓毒性小,骨髓和脾脏的有核细胞在7-10天迅速恢复至正常水平;而且可显著提高移植后的供者嵌合率,移植后+21天后逐渐稳定在骨髓（28.70±5.90）%,脾脏（46.40±5.00）%,显著高于6.5GyTBI组的（6.08±0.46）%、化疗组的（10.2±2.40）%和Auto-NK+化疗组的（8.01±2.12）%,并持续3个月（P＜0.05）。与化疗组相比,Allo-NK+化疗组出现的GVHD反应轻微,仅有50%（5/10）受鼠出现体重减轻,Allo-NK+化疗组的肝脏、小肠、肾脏及皮肤的病理切片均未见明显的组织损伤。Allo-NK+化疗组接受DLI的小鼠,回输后8h～24h供者淋巴细胞在受者肺脏、脾脏、肾脏中明显蓄积,且浓度最高,时间最长。利用重复测量法发现,Allo-NK+化疗组复发肿瘤明显小于化疗组（P＜0.01）。至实验结束时Allo-NK+DLI组肿瘤明显小于不给治疗的Allo-NK+PBS组和化疗+DLI组,肿瘤抑制率分别为（70.62±3.75）%,（50.87±6.07）%和（55.94±3.98）%（P＜0.05）,且镜下可观察到肿瘤局部有较多的淋巴细胞浸润。Allo-NK+DLI组中MCP-1、IL-17、IL-12、和MCP-5较对照组分别升高1.56倍、1.36倍、1.20倍和1.17倍;而IL-10降低1.75倍。MLR结果显示,与正常C57小鼠相比,化疗组和Allo-NK+化疗组的增殖指数（SI）降低,而Allo-NK+化疗组降低程度尤甚（P＜0.05）,其中增殖抑制作用主要来源于CD4+T细胞中的CD4+CD25+T细胞,并呈剂量效应依赖关系。ELISA法检测发现,Allo-NK+化疗组的CD4+T细胞和CD4+CD25+T细胞可以显著抑制供者特异性IFN-γ分泌。流式细胞仪检测结果示Allo-NK+化疗组在移植后23d脾脏中出现一群新生的CD4+CD25+CD127-Treg细胞,而化疗组组未见。荧光定量PCR扩增结果显示Allo-NK+化疗组CD4+CD25+T细胞中Foxp3表达显著升高,高于化疗组（P＜0.05）,而IL-2、IFN-γ和IL-4的表达低于化疗组（P＜0.05）。流式细胞仪检测表明Allo-NK+化疗组移植后14d的胸腺CD11c+DC细胞成熟度明显低于化疗组,与正常C57BL/6小鼠CD3+T细胞共孵育5d后可诱导出（25.58±6.21）%的CD4+CD25+CD127-Treg细胞,加入供受者MLR反应体系可显著抑制供者特异性IFN-γ释放。荧光定量PCR扩增显示诱导后的CD3+T细胞高表达FoxP3,与正常C57BL/6相比IL-2、IL-4、IL-10和TGF-β表达量升高,而IFN-γ表达量下降。RayBio?小鼠细胞因子芯片检测显示IL-4,IL-6,IL-17,MCP-1分别升高1.42,3.57,1.87,1.57倍;而GM-CSF,IL-12p40,IFN-γ,RANTES,sTNFRI,VEGF分别降低1.49,1.52,1.61,1.56,2.76倍。结论:Allo-NK预处理可减少GVHD强度,并通过诱导移植早期供者特异性免疫耐受促进供者造血干细胞植入,延长供者淋巴细胞在受者体内停留时间,抑制移植后肿瘤复发。移植早期供者免疫耐受可能是通过胸腺中不成熟的供者DC细胞诱导生成的供者特异性CD4+CD25+CDl27-Treg细胞介导的。
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