菊花茎尖超低温保存及遗传稳定性评价

论文摘要

菊花是世界四大生鲜切花之一,我国有着丰富的菊属及其近缘属植物种质资源。其保存一般通过繁种圃或保存圃的田间种植方式来实现。然而,这种保存方式不仅占用耕地,栽培管理耗时、费力,而且可能受干旱、洪涝、低温、热害、病虫害等自然灾害的影响而导致种质毁灭,另外,在不断的种植过程中容易发生自然变异。超低温保存被认为是这类资源最为经济和安全的保存方法。超低温条件下,植物的生理生化活性近乎停止,贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内,是基因资源长期保存最有希望的方法之一。然而,由于受超低温保存的条件所限,特别是针对不同类型的资源需要建立不同的技术流程,超低温保存研究目前报道较少。本试验立足于建立菊花（Dethendrama morifolium）茎尖的超低温保存技术体系,主要结果如下:1建立了适合超低温保存的菊花组培体系不同外植体的研究表明,花托的诱导率较高,是始花期菊花建立再生体系的理想材料,始花期和盛花期的茎段容易污染,不宜做外植体;不同植物生长调节剂配比的MS培养基研究表明,采用BA 3mg/L和NAA 0.01mg/L的培养基,对于始花期菊花管状花的分化和增殖较好,成苗率最高,达到300%。以试管苗为材料,通过改变光照强度和培养基的蔗糖浓度,进行加强试管苗研究。结果表明,菊花在1800-3500 1x的光照强度下无明显差异,在相同光照条件下,0.2mol/L蔗糖浓度的菊花,外观看上去形态较一致,生长速度也适当得到抑制,叶色、株型等良好,更适合于进行超低温保存。2菊花超低温保存体系的建立预培养研究表明,超低温保存之前必须对茎尖进行预培养,在0.4mol/L蔗糖浓度的MS培养基上预培养3d的菊花茎尖成活率最高,没有经过预培养的菊花茎尖成活率很低甚至无成活;预处理液处理时间研究表明,经过30min的预处理,可以显著提高菊花茎尖的成活率。把材料茎尖玻璃化的试验表明,0℃下用PVS2处理15min,成活率最高可达85.7%,超过15min成活率明显下降;PVS2作为玻璃化试剂与PVS3和MPVS2相比,脱水效果较好,表明用PVS2处理菊花进行超低温保存是比较恰当的。用玻璃化法、包埋脱水法和程序降温法对菊花茎尖进行超低温保存,玻璃化法保存后的成活率最高,可达85.7%,包埋脱水法次之,达到50.0%,程序降温法处理过的茎尖没有成活。解冻后茎尖转移至恢复培养基,固体培养基较半固体培养基更有利于茎尖再生。成活的茎尖在3-14d产生萌动迹象,进一步生长再生成苗。成活的茎尖再生率可达100%。综上所述,玻璃化法保存菊花茎尖的优化程序为:1-2mm的菊花茎尖在MS+0.4mol/L蔗糖的培养基上,4℃条件下暗培养3d,在25℃下经预处理液处理30min,再于0℃下用PVS2处理15min后,换入新鲜PVS2并迅速投入液氮。24h后,在40℃水浴中快速化冻2min,用MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗涤20min,滤纸吸干后接种到恢复培养基中,暗培养或弱光培养3d后转入正常光培养。3超低温保存菊花种质的遗传稳定性研究采用SRAP标记对冻后分化的22株再生苗进行了遗传稳定性鉴定。采用24个引物扩增出1080条带,虽然发现有9条新带或缺失带,对这22个再生植株的SRAP标记产物进行聚类分析,结果显示这些再生植物相似系数在0.96以上,初步说明保存后再生植物遗传稳定,该保存方法可应用于菊花的长期稳定保存。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 问题的提出
• 1.1.1 菊花的栽培价值
• 1.1.2 超低温保存的必要性
• 1.2 前人研究进展
• 1.2.1 菊花的组织培养快繁研究
• 1.2.2 超低温保存研究
• 2 材料和方法
• 2.1 菊花组织培养研究
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 菊花不同外植体繁殖
• 2.1.3 其它种群菊花不同外植体繁殖
• 2.1.4 菊花壮苗试验
• 2.1.5 小植株的生根和移栽
• 2.1.6 试验条件
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同激素配比的培养基对菊花管状花的诱导效果
• 2.2.2 不同外植体的诱导效果
• 2.2.2.1 菊花不同外植体的诱导效果
• 2.2.1.2 其它种群不同外植体的诱导效果
• 2.2.3 菊花壮苗试验
• 2.2.3.1 不同逆境培养基对菊花生理状况的影响
• 2.2.3.2 光照和蔗糖浓度梯度的双因素试验
• 2.3 讨论
• 2.3.1 不同管状花个体在相同培养基上表现有差异
• 2.3.2 不同激素配比对菊花管状花的影响
• 2.3.3 不同材料对相同激素配比的响应不尽相同
• 2.3.4 开花期的菊花采用花器官做外植体较为理想
• 2.3.5 影响菊花植株健壮的因素
• 3 菊花超低温保存技术研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试材料
• 3.1.2 剥茎尖
• 3.1.3 菊花超低温保存
• 3.1.3.1 玻璃化法
• 3.1.3.2 包埋玻璃化法
• 3.1.3.3 程序降温法
• 3.1.4 解冻及恢复培养
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 预培养培养基的蔗糖浓度及预培养时间对茎尖存活率影响
• 3.2.2 装载时间对茎尖存活率影响
• 3.2.3 不同玻璃化试剂对存活率影响
• 3.2.4 玻璃化试剂处理时间对存活率影响
• 3.2.5 不同方法的存活率比较
• 3.2.6 不同品种对此超低温保存方法的适用性
• 3.2.7 茎尖恢复培养与植株再生
• 3.3 讨论
• 3.3.1 材料选择对菊花超低温保存的影响
• 3.3.2 预培养对菊花超低温保存的影响
• 3.3.3 预处理对菊花超低温保存的影响
• 3.3.4 冰冻保护剂选择及处理
• 3.3.5 冷冻及解冻对菊花超低温保存的影响
• 3.3.6 恢复培养基对超低温保存茎尖再生的影响
• 3.3.7 茎尖成活评价
• 3.3.8 其他
• 4 超低温保存再生菊花的遗传稳定性评价
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 植株形态和园艺性状比较
• 4.1.3 SRAP标记法检测遗传变异
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 形态特征比较
• 4.2.2 SRAP标记检测遗传变异
• 4.2.3 SRAP标记聚类分析:
• 4.3 讨论
• 4.3.1 遗传标记的选择
• 4.3.2 变异的由来
• 5 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历