罗非鱼和南方鲇生殖细胞几种分子标记的克隆和表达研究

论文摘要

性别决定和分化一直是生物学、生理学、内分泌学研究的热点问题之一。鱼类的性别在很大程度上受到环境因素如:温度、光照、外源性激素水平的影响,甚至还能导致性逆转。过去,对于性别分化的研究主要集中在对性腺体细胞的分化方面,相继克隆了许多在鱼类性别决定和分化中起重要作用的基因,并对其功能进行了深入研究。近年来,由于对性别分化的认识不断加深,加上鱼类养殖的要求,对生殖细胞的分化和发育逐渐成为一个研究的热点。对鱼类生殖细胞标记（germ cell marker）基因进行研究将为深入开展对鱼类生殖细胞分化和发育分子机制研究,拓展对这一领域的认识奠定坚实基础,也对水产养殖业具有指导意义。本研究所用模式动物尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）具有生长速度快、性成熟时间快、繁殖周期短等特点,是世界最重要的养殖鱼类之一。利用现代生物学手段对其进行单性化的养殖提出了新的要求。因此对罗非鱼性别分化,特别是生殖细胞的分化和发育进行研究具有重要的理论意义和应用价值。本实验从尼罗罗非鱼克隆了几种生殖细胞标记,研究了它们的组织表达模式和在个体发生中的表达。同时我们还利用fadrozole（芳香化酶抑制剂）、雌二醇处理,人工诱导雌雄性逆转罗非鱼,研究了生殖细胞标记在这些性逆转鱼性腺中的表达变化情况。采用RT-PCR和RACE相结合的方法,克隆了两个尼罗罗非鱼早期发育阶段的生殖细胞标记:Figla和Oct4。克隆得到的Figla序列长度为1254 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）长度为594碱基（base pair,bp）,编码197个氨基酸（amino acid,aa）。Oct4序列长度为1787 bp,ORF长度为1380 bp,编码459个aa。它们在卵巢中的表达均高于精巢。罗非鱼Figla（ntFigla）m RNA从孵化后第5天（days after hatching,dah）开始表达于雌性和雄性性腺中,并从10 dah开始呈现性别二态性表达,RT-PCR和定量RT-PCR（quantitative RT-PCR,qRT-PCR）都显示,直到70 dah ntFigla在精巢的mRNA水平都维持较低水平。而性成熟后,它在精巢的表达明显增加。ntOct4 mRNA在性腺发育的早期高表达,这暗示它在这个阶段可能具有重要功能。但在孵化后1个月通过原位杂交可以检测到它的性别二态性表达,之后它在卵巢中持续高水平表达,而在精巢中表达量逐渐降低,直到检测不到。采用RT-PCR和RACE相结合的方法,我们从尼罗罗非鱼克隆了两个与生殖细胞减数分裂相关的基因:Spo11和Scp3。Spo11是最早分离得到的减数分裂重组基因之一,而Scp3是减数分裂联会复合体（Synaptonemal complex,SC）的主要结构蛋白,它们均为减数分裂特异的标记。Scp3的cDNA序列为1070 bp,ORF为717 bp,编码238个aa;尼罗罗非鱼Spo11序列为1468 bp,ORF为1173 bp,编码390个aa。组织分布结果表明,两者都在罗非鱼性腺中特异表达,ntScp3主要表达于精巢,而ntSpo11主要表达于卵巢。它们都能用作检测处于减数分裂的生殖细胞。在个体发生研究结果表明,Scp3 mRNA的表达总是精巢高于卵巢,这种差异一直持续到性成熟。在卵巢中,ntScp3 mRNA主要在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ时相的卵母细胞中表达,在第Ⅳ时相的卵母细胞中表达量低,且主要集中在细胞边缘。ntSpo11主要在卵巢中表达,这种性别差异均能在不同时期（10 dah、30 dah、40 dah、5个月和成体）检测到。Vasa蛋白是DEAD-box蛋白家族成员中一种ATP依赖的RNA解旋酶,它在高等后生动物的生殖细胞形成中起着关键的作用。Vasa基因特异性地表达于许多后生动物的生殖细胞中,并被广泛确定为许多脊椎动物和无脊椎动物生殖细胞的特异标记。采用RT-PCR和RACE相结合的方法,从南方鲇中分离得到Vasa基因的两个亚型,scVasa和scVasa-s。通过RACE方法获得了它们的全长。核苷酸序列分析显示,scVasa cDNA序列全长2,563bp,其中开放阅读框ORF长1,989bp,可以编码含662个氨基酸的蛋白;scVasa-s cDNA序列全长2,475bp,其中开放阅读框ORF长1,926bp,可以编码含641个氨基酸的蛋白。scVasa-s缺乏scVasa N末端区域的一段序列。这两种推导出的氨基酸序列均具有DEAD-box蛋白家族成员的特征,即含有4个精氨酸-甘氨酸-甘氨酸（RGG）基序和另外8个保守基序。它们和银鲫的Vasa同源蛋白有很高的相似性（75.2%和73.8%）。原位杂交结果表明:在卵巢,scVasa主要在Ⅰ、Ⅱ时相的卵母细胞表达,而在精巢,主要在精原细胞和初级精母细胞表达。半定量PCR结果显示,在生殖周期中,两种亚型在以Ⅱ时相卵母细胞为主体的卵巢恢复期表达均高于以Ⅲ-Ⅳ时相卵母细胞为主体的卵黄生成期。本研究首次从硬骨鱼类罗非鱼和南方鲇系统的克隆了生殖细胞和减数分裂的几种分子标记。尽管目前国内外众多学者对生殖细胞和减数分裂的分子标记进行了深入广泛的研究,但是大都集中在模式生物如小鼠、斑马鱼和青鳉上,而对具有重要经济意义的水产养殖鱼类的研究却很少,甚至是空白,因而本研究通过对我国重要的养殖鱼类罗非鱼和南方鲇的生殖细胞和减数分裂的分子标记的表达模式以及它们在药物处理性逆转过程中的表达变化,为最终通过生物技术手段解释性别分化的机制、对减数分裂起始的调控机制、体细胞和生殖细胞的相互关系的研究奠定基础,而且在未来的水产养殖业中有非常广阔的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 脊椎动物鱼类生殖细胞分子标记研究概况
• 1.1 鱼类的性别决定
• 1.2 鱼类的性别分化
• 1.3 类固醇激素对鱼类的性分化的作用
• 1.4 外源性类固醇激素对鱼类的性分化的作用
• 1.5 内源性类固醇激素和鱼类性分化的关系
• 1.6 鱼类生殖细胞分化的研究
• 1.7 鱼类原始生殖细胞（PGCs）的特征
• 1.8 鱼类原始生殖细胞（PGCs）的起源、迁移和分化
• 1.8.1 鱼类原始生殖细胞的起源
• 1.8.2 鱼类原始生殖细胞的迁移
• 1.8.3 鱼类原始生殖细胞及性腺的分化
• 1.8.4 PGCs发生和发育的有关基因及分子特征
• 1.9 生殖细胞的发生和分子标记
• 1.9.1 生殖细胞的特异性标记
• 1.10 本项目的立项依据
• 第2章 南方鲇Vasa两种亚型cDNA的克隆及其表达研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 材料和试剂
• 2.2.2 基因克隆
• 2.2.3 南方鲇Vasa部分基因组序列的确定
• 2.2.4 scVasa和scVasa-s序列分析与Vasa进化树的构建
• 2.2.5 南方鲇Vasa两个亚型mRNA在各组织中的分布
• 2.2.6 原位杂交
• 2.2.7 两个亚型mRNA在不同时期卵巢的表达
• 2.3 结果
• 2.3.1 南方鲇scVasa和scVasa-s序列
• 2.3.2 南方鲇Vasa部分基因组序列
• 2.3.3 南方鲇scVasa和scVasa-s序列分析和进化树分析
• 2.3.4 南方鲇scVasa和scVasa-s mRNA的组织表达模式
• 2.3.5 原位杂交
• 2.3.6 南方鲇scVasa和scVasa-s mRNA在VS和ORS卵巢中的表达变化
• 2.4 讨论
• 2.4.1 南方鲇scVasa和scVasa-s序列分析
• 2.4.2 南方鲇Vasa两个亚型的组织分布
• 2.4.3 南方鲇性腺中scVasa表达的细胞类型
• 2.4.4 南方鲇scVasa和scVasa-s在卵黄生成期（VS）和卵巢恢复期（ORS）的表达变化
• 第3章 尼罗罗非鱼Scp3基因的克隆和表达分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验动物
• 3.2.2 菌株、克隆载体、工具酶
• 3.2.3 罗非鱼Scp3基因的克隆
• 3.2.4.Scp3序列分析与Scp3进化树的构建
• 3.2.5 罗非鱼Scp3 mRNA在各组织中的分布
• 3.2.6 罗非鱼Scp3 mRNA在罗非鱼性腺个体发生中的表达
• 3.2.7 原位杂交（in situ hybridization,ISH）检测Scp3表达情况
• 3.2.8 原位杂交分析罗非鱼Scp3 mRNA在性腺个体发生中的表达
• 3.3 结果
• 3.3.1 罗非鱼Scp3序列
• 3.3.2 罗非鱼Scp3序列分析和进化树分析
• 3.3.3 罗非鱼Scp3 mRNA的组织表达模式
• 3.3.4 RT-PCR分析罗非鱼Scp3 mRNA的个体发生
• 3.3.5 原位杂交分析罗非鱼Scp3 mRNA的个体发生
• 3.3.6 原位杂交分析罗非鱼Scp3 mRNA药物处理性逆转性腺中的表达
• 3.4 讨论
• 3.4.1 罗非鱼Scp3序列及系统分析
• 3.4.2 罗非鱼Scp3的组织表达模式
• 3.4.3 RT-PCR和原位杂交对罗非鱼Scp3的系统发生分析
• 3.4.4 原位杂交研究Scp3在性逆转鱼性腺中的表达
• 第4章 尼罗罗非鱼Figla基因的克隆和表达分析
• 4.1 前言
• 4.1.1 Figla研究现状
• 4.1.2 Figla基因结构
• 4.1.3 Figla蛋白结构
• 4.1.4 Figla基因功能
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 实验动物
• 4.2.2 菌株、克隆载体、工具酶
• 4.2.3 Figla cDNA的分子克隆
• 4.2.4 Figla在尼罗罗非鱼各组织中的表达分布
• 4.2.5 系统进化树分析
• 4.2.6 通过RT-PCR分析Figla表达
• 4.2.7 原位杂交
• 4.3 结果
• 4.3.1 尼罗罗非鱼Figla序列分析
• 4.3.2 系统发生分析
• 4.3.3 尼罗罗非鱼Figla组织分布
• 4.3.4 RT-PCR检测尼罗罗非鱼发育过程中Figla的表达情况
• 4.3.5 实时定量RT-PCR检测个体发生过程中Figla的表达情况
• 4.3.6 原位杂交 in situ hvbridization
• 4.4 讨论
• 4.4.1 所测出序列为尼罗罗非鱼Figla序列
• 4.4.2 Figla可用于卵母细胞特异标记
• 4.4.3 研究Figla的意义
• 第5章 尼罗罗非鱼Oct-4基因的克隆和表达分析
• 5.1 前言
• 5.1.1 Oct4基因结构和定位
• 5.1.2 Oct4基因的功能
• 5.1.3 Oct4基因的调控和相互作用
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 实验动物
• 5.2.2 菌株、克隆载体、工具酶
• 5.2.3 罗非鱼Oct4基因的克隆
• 5.2.4 Oct4序列分析与Oct4进化树的构建
• 5.2.5 罗非鱼Oct4在雌雄成鱼的组织表达模式的研究
• 5.2.6 原位杂交（in situ hybridization,ISH）
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 尼罗罗非鱼Oct4 cDNA和氨基酸全序列
• 5.3.2 序列分析和进化树的构建
• 5.3.3 罗非鱼Oct4 mRNA的组织表达模式
• 5.3.4 个体发生和药物处理性逆转过程中的Oct4 mRNA原位杂交检测
• 5.4 讨论
• 5.4.1 罗非鱼Oct4序列及其系统发生分析
• 5.4.2 Oct4的组织表达模式
• 5.4.3 原位杂交分析Oct4在雌雄性腺发育过程中的表达
• 第6章 尼罗罗非鱼Spo11基因的克隆和表达分析
• 6.1 前言
• 6.1.1 基因克隆
• 6.1.2 基因表达
• 6.1.3 基因功能
• 6.1.4 基因定位
• 6.1.5 动物模型
• 6.1.6 研究意义
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 实验动物
• 6.2.2 菌株、克隆载体、工具酶
• 6.2.3 罗非鱼Spo11基因的克隆
• 6.2.4 Spo11序列分析与Spo11进化树的构建
• 6.2.5 Spo11组织分布
• 6.2.6 原位杂交（in situ hybridization,ISH）
• 6.3 结果
• 6.3.1 罗非鱼Spo11序列
• 6.3.2 罗非鱼Spo11序列分析和进化树分析
• 6.3.3 罗非鱼Spo11 mRNA的组织表达模式
• 6.3.4 原位杂交分析罗非鱼Spo11 mRNA的个体发生
• 6.3.5 原位杂交分析罗非鱼Spo11 mRNA药物处理性逆转性腺中的表达
• 6.3.6 实时定量RT-PCR检测个体发生过程中Spo11的表达情况
• 6.4 讨论
• 6.4.1 所测出序列为尼罗罗非鱼Spo11序列
• 6.4.2 Spo11可用于处于减数分裂的生殖细胞的特异标记
• 6.4.3 Spo11在性逆转鱼性腺中的表达
• 结论
• 参考文献
• 主要的实验方法
• 致谢
• 在学期间所发表的文章和参加科研情况