犬α7干扰素在大肠杆菌与毕赤酵母中的活性表达及分析

论文摘要

干扰素（Interferon, IFN）是由特定细胞产生的一类具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性的分泌型糖蛋白,是机体防御系统的重要组成部分。近年来,由于干扰素具有无药物残留,无毒副作用的特点,使其在防治畜禽疫病特别是病毒性疫病方面越来越受到关注。但是犬干扰素-α（CaIFN-α）的研究和应用相对落后。1.为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬α干扰素,在犬肝脏组织中克隆获得犬α干扰素第7亚型（CaIFN-α7）基因,通过融合PCR的方法在犬α干扰素的N端无缝连接内含肽Ssp DnaB intein （SDI）基因,然后连接入pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的重组表达载体。重组载体在大肠杆菌感受态Rosetta中经IPTG诱导高效表达可溶性CaIFN-α蛋白,经直链淀粉树脂纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。重组蛋白在MDCK上对CDV及VSV的抑制活性分别为3.5×105U/mg和3.9×105U/mg。2.为了使表达的犬α干扰素具有无冗余氨基酸的N端,本研究将犬α干扰素基因连接入pPICZαA载体的分泌信号肽序列后,用LiCl转化法转化入酵母菌GS115中,对培养基上清进行简单处理进行SDS-PAGE分析,表达的蛋白约25ku。分析原因,是由于在犬α干扰素基因序列中有2个潜在的糖基化位点,表达产物被糖基化修饰。酵母表达的犬α干扰素在MDCK上抑制CDV及VSV的活性分别为9.6×106U/mg和1.1×107U/mg。选择9株重组酵母中表达量最高的9号重组酵母进行发酵罐扩大培养,对发酵培养产物进行SDS-PAGE和抗病毒活性分析,证实其在MDCK上抑制CDV及VSV的活性分别为2.1×106U/mg和2.6×106U/mg。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 干扰素概述
• 1.2 干扰素的分类和特点
• 1.3 IFN-α的结构及生物学活性
• 1.4 干扰素抗病毒活性的作用机制
• 1.5 犬α干扰素的研究概况
• 1.6 内含肽介导的大肠杆菌表达系统
• 1.6.1 大肠杆菌表达系统
• 1.6.2 提高重组蛋白可溶性表达的方法
• 1.6.3 内含肽的应用
• 1.7 利用毕赤酵母表达系统表达外源蛋白
• 1.8 研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒、宿主菌、病毒
• 2.1.2 细胞、培养基
• 2.1.3 酶和生化试剂
• 2.1.4 主要仪器和设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 犬α干扰素多克隆抗体的制备
• 2.2.2 内含肽-融合标签介导的犬α干扰素在大肠杆菌中的高效可溶性表达
• 2.2.3 犬α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达
• 2.2.4 发酵工艺的初步研究
• 2.2.5 表达的犬α干扰素与某品牌犬α干扰素的比较
• 3 结果与分析
• 3.1 犬α干扰素多克隆抗体的制备
• 3.1.1 在犬基因组中PCR获得CaIFN-α的序列
• 3.1.2 重组质粒pEASY-Blunt-Simple-CaIFN-α的PCR鉴定
• 3.1.3 重组质粒pGEX-6p-1-CaIFN-α的构建
• 3.1.4 重组蛋白的表达及多抗血清的制备
• 3.2 内含肽-融合标签介导的在大肠杆菌中的高效可溶性表达
• 3.2.1 重组表达载体pMAL-c2X-SDI-CaIFN-α的构建
• 3.2.2 融合蛋白的表达及鉴定
• 3.2.3 CaIFN-α抗病毒活性分析
• 3.3 犬α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达
• 3.3.1 pPICZαA-CaIFN-α酵母表达载体的构建
• 3.3.2 重组酵母的鉴定
• 3.3.3 CaIFN-α在毕赤酵母中的表达及鉴定
• 3.3.4 用Dot-ELISA（免疫酶斑点技术）比较9株重组酵母的表达量
• 3.3.5 普通摇瓶与挡板摇瓶表达犬α干扰素的比较
• 3.3.6 重组CaIFN-α抗病毒活性分析
• 3.4 重组酵母在发酵罐中的表达
• 3.4.1 不同时间点酵母菌体湿重
• 3.4.2 间接ELISA法检测重组蛋白的表达
• 3.4.3 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达及蛋白表达量
• 3.4.4 发酵罐培养毕赤酵母表达重组蛋白的抗病毒活性
• 3.5 表达的犬α干扰素与市场上某品牌犬α干扰素的比较
• 4 讨论
• 4.1 在大肠杆菌中影响外源蛋白进行可溶性表达的因素
• 4.1.1 内含肽标签对蛋白可溶性的影响
• 4.1.2 表达载体对蛋白可溶性的影响
• 4.1.3 温度对蛋白可溶性的影响
• 4.2 毕赤酵母的表达载体的构建
• 4.3 毕赤酵母对表达的外源蛋白的糖基化影响
• 4.4 毕赤酵母中提高外源蛋白表达量的策略
• 4.5 CaIFN-α活性的测定
• 4.6 发酵工艺的初步研究
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文