猪圆环病毒2型去除NLS ORF2基因的原核表达和琼脂扩散实验检测方法的建立

论文摘要

圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）属圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属成员,为单股、环状、负链、无囊膜的DNA病毒,是已知的最小动物病毒之一,大小约17～20nm,呈二十面体对称。根据病毒抗原性、基因组成不同,可将其分为2个基因型或称血清型,即PCV1型和PCV2型。PCV1无致病性,PCV2具有致病性,是断乳仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）等相关疾病的主要病原。PCV2基因组全长1767bp或1768bp,包括11个读码框,其中ORF2编码PCV2的主要结构蛋白Cap蛋白,该蛋白具有较强的免疫原性,核苷酸序列同源性与PCV1相比仅为66%,与PCV1的血清没有交叉反应性,适合用于血清学的检测,ORF2的特性使其能成为在分子水平上诊断PCV2的理想抗原。PCV2 N端41个氨基酸与Cap蛋白的核内定位密切相关,其中12～18位及34～41位的氨基酸对Cap蛋白的核内定位起着决定性作用。根据PCV2-871病毒株的已知序列设计一对引物,PCR扩增其去核定位信号的ORF2基因,通过BamH I/ HindⅢ双酶切位点将其克隆到表达载体pQE-32中,于大肠杆菌M15中转化。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定,表明去核定位信号的Cap蛋白可以大量表达,表达量占全菌体的55.9%,Western blot、ELISA鉴定蛋白活性,结果表明:该蛋白具有良好的抗原活性。本实验中利用原核表达的重组蛋白建立了琼脂扩散实验的检测方法。根据可溶性抗原与相应抗体混合,在电解质存在时,经过一定时间在琼脂凝胶上进行的沉淀反应,抗原、抗体结合物形成白色絮状沉淀,谓之沉淀线。可溶性抗原和抗体能在凝胶中自由扩散,二者在琼脂凝胶中相遇,在比例最适处出现肉眼可见的沉淀线（或称沉淀带）,该检测方法确定了琼脂板的最佳配制比例,进行了重复性、特异性的实验,结果表明该方法具有良好的重复性、特异性,抗原应用浓度在0.911.83 mg/mL范围之内,可以做为检测抗原。该检测方法具有操作简便、快速、适合基层应用的优势。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 猪圆环病毒病原学研究进展
• 1.1.1 病毒的发现
• 1.1.2 病毒的理化性质
• 1.1.3 病毒复制方式与培养特性
• 1.1.4 PCV 分子生物学研究进展
• 1.2 猪圆环病毒流行病学
• 1.2.1 宿主范围和传播方式
• 1.2.2 病毒感染现状
• 1.3 致病性
• 1.4 症状
• 1.5 病理变化
• 1.6 组织学研究
• 1.7 血清学研究
• 1.8 诊断方法
• 1.8.1 电镜法
• 1.8.2 免疫荧光法
• 1.8.3 ELISA 诊断方法
• 1.8.4 PCR 方法
• 1.8.5 核酸探针及原位杂交方法
• 1.9 琼脂扩散实验的研究进展
• 1.10 课题研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 病毒
• 2.1.2 细胞与实验动物
• 2.1.3 原核表达载体与菌株
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PCV2 病毒的增殖
• 2.2.2 病毒DNA 提取
• 2.2.3 去除NLS Cap 基因的克隆
• 2.2.4 重组蛋白的原核表达及纯化、鉴定
• 2.2.5 琼脂扩散实验检测方法的建立
• 3 结果与分析
• 3.1 去除NLSCAP 蛋白的克隆
• 3.1.1 去除NLSCap 基因的扩增
• 3.1.2 pQE-32 载体的处理
• 3.1.3 重组阳性质粒的酶切鉴定
• 3.2 重组蛋白的表达及纯化、鉴定
• 3.2.1 重组蛋白的表达、纯化
• 3.2.2 重组蛋白活性鉴定
• 3.3 琼脂扩散实验检测方法的建立
• 3.3.1 琼脂扩散实验的工作条件优化
• 3.3.2 特异性实验
• 3.3.3 稳定性实验
• 3.3.4 符合率实验
• 4 讨论
• 4.1 去除NLS CAP 基因的重组蛋白表达的目的
• 4.2 原核表达条件的优势
• 4.2.1 大肠杆菌表达系统研究进展
• 4.2.2 表达载体
• 4.2.3 载体的优势
• 4.2.4 诱导培养基中IPTG 浓度的优化
• 4.3 琼脂扩散实验检测PCV2 的优势
• 4.4 影响琼脂扩散实验的因素
• 4.4.1 琼脂板的制备
• 4.4.2 抗原抗体浓度的影响
• 4.4.3 琼脂板与平皿底部脱离对检验结果的影响
• 4.4.4 琼脂板孔内表面干燥对扩散速度的影响
• 4.4.5 加样的原则
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的论文