嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因的克隆和表达

论文摘要

几丁质广泛分布于动物、微生物体内,是自然界中含量仅次于纤维素的生物多聚物。其专一性水解酶——几丁质酶（chitinase）已成为当前研究的热点,它除了被用于植物病原真菌和害虫的生物防治,还可以用作外敷药物治疗由真菌引起的人类疾病;可以制备酵母和丝状真菌的原生质体。分离几丁质酶基因、构建高效表达工程菌,对实现几丁质酶产业化具有重要意义。嗜热子囊菌光孢变种（Thermoascus aurantiacus var. levisporus）是一种广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,能够在45℃～50℃的高温下很好的繁殖生长。本文以嗜热子囊菌光孢变种为材料,根据已获得的几丁质酶基因中间片段,通过RACE技术获得了嗜热子囊菌光孢变种的几丁质酶的全长基因Tachit,该基因已在GenBank中注册,登录号为EF608144。构建了原核表达载体pET22b（+）/Tachit并转化大肠杆菌E. coli BL21,经过IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测,在约44kDa处有一条明显的蛋白带,可溶性分析结果显示,其表达产物主要以包涵体形式存在。另外分别构建了胞内表达载体pPIC3.5K/Tachit和酵母分泌型表达载体pPIC9K/Tachit并转化Pichia pastoris GS115,得到产几丁质酶的工程菌株。通过甲醇诱导,对酶液进行硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析获得了凝胶电泳均一的分子量约为45kDa几丁质酶。重组几丁质酶TACHIT的最适反应温度和pH分别为50℃和8.0,该酶在50℃以下稳定;在pH值为6～11之间重组几丁质酶保持稳定的酶活性。。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 几丁质酶的研究进展
• 1.1 几丁质的结构
• 1.2 几丁质的降解方式
• 1.3 几丁质酶的研究历史和现状
• 1.4 几丁质酶的分类和关系
• 1.5 几丁质酶的抗病作用
• 1.6 微生物几丁质酶的分子生物学
• 1.6.1 信号肽序列
• 1.6.2 催化域
• 1.6.3 几丁质结合区域
• 1.6.4 C 端序列
• 1.7 几丁质酶的应用
• 2 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展
• 2.1 巴斯德毕赤酵母的特性
• 2.2 毕赤酵母宿主菌和表达载体的类型
• 2.3 表达载体在毕赤酵母中的整合
• 2.4 巴斯德毕赤酵母中信号肽的剪切过程
• 2.5 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白展望
• 3 本研究的目的意义及研究内容
• 3.1 本研究的目的意义
• 3.2 研究内容
• 第二章 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因克隆及序列分析
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 酶和生化试剂
• 1.1.3 仪器
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 溶液配制
• 1.1.6 PCR 引物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 总RNA 的提取（Trizol 法）
• 1.2.2 紫外检测RNA 产率和纯度
• 1.2.3 反转录cDNA 第一链的合成
• 1.2.4 目的基因3’末端的分离（3’-RACE）
• 1.2.4.1 目的基因3’末端的扩增
• 1.2.4.2 PCR 产物回收
• 1.2.4.3 载体连接
• 1.2.4.4 大肠杆菌 E.coli 感受态细胞的制备和转化
• 1.2.4.4.1 大肠杆菌感受态的制备
• 1.2.4.4.2 大肠杆菌感受态的转化
• 1.2.4.5 重组质粒的筛选与鉴定
• 1.2.4.5.1 IPTG-X-gal 筛选
• 1.2.4.5.2 菌落 PCR 检测
• 1.2.4.5.3 碱法小量提取质粒 DNA
• 1.2.4.5.4 质粒 DNA 的酶切鉴定
• 1.2.4.5.5 序列测定
• 1.2.5 目的基因5’末端的分离（5’-RACE）
• 1.2.5.1 cDNA 第一链的合成
• 1.2.5.2 cDNA 第一链的纯化
• 1.2.5.3 cDNA 第一链的加尾
• 1.2.5.4 RACE-PCR 扩增
• 1.2.5.5 二次 PCR（巢式PCR）
• 1.2.6 目的基因全长cDNA 的克隆
• 1.2.7 全长序列的生物信息学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 嗜热子囊菌光孢变种总RNA 的提取
• 2.2 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因cDNA3’-末端的分离
• 2.3 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因cDNA 5’-末端的分离
• 2.4 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因全长cDNA 的分离
• 2.5 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析
• 2.5.1 几丁质酶基因Tachit 的核苷酸序列分析
• 2.5.2 几丁质酶基因 Tachit 的预测蛋白氨基酸序列分析
• 2.5.3 几丁质酶基因Tachit 的预测蛋白氨基酸组成
• 3 讨论
• 3.1 几丁质酶基因克隆的策略
• 3.2 RACE 技术应注意的问题
• 第三章 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 酶和生化试剂
• 1.1.3 培养基及有关溶液的配制
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 几丁质酶基因片段的分离
• 1.2.1.1 几丁质酶基因序列的限制性酶切位点分析
• 1.2.1.2 引物设计
• 1.2.2 几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达
• 1.2.2.1 几丁质酶基因原核表达载体的构建
• 1.2.2.2 几丁质酶基因的原核诱导表达
• 1.2.2.3 表达蛋白的可溶性分析
• 1.2.2.4 表达蛋白的几丁质酶活性测定
• 1.2.3 几丁质基因在毕赤酵母中的表达
• 1.2.3.1 酵母表达载体的构建
• 1.2.3.2 酵母转化
• 1.2.3.2.1 线性化质粒 DNA 的制备
• 1.2.3.2.2 Pichia pastoris GS115 感受态细胞的制备（电击法）
• 1.2.3.2.3 电击转化酵母感受态细胞
• 1.2.3.3 酵母转化子的筛选与鉴定
• 1.2.3.3.1 酵母转化子甲醇利用表型的平板筛选
• 1.2.3.3.2 酵母基因组 DNA 的分离
• 1.2.3.4 酵母转化子的 PCR 鉴定
• 1.2.3.5 外源基因多拷贝整合转化子筛选
• 1.2.3.6 酵母工程菌的培养和几丁质酶的诱导表达
• 1.2.3.7 重组酵母表达产物的生物学活性检测
• 1.2.3.7.1 pPIC3.5K 胞内表达的酶活测定
• 1.2.3.7.2 pPIC9K 分泌表达的酶活测定
• 1.2.3.8 重组酵母表达产物的SDS-PAGE 分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 几丁质酶编码序列的分离
• 2.2 几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达
• 2.2.1 几丁质酶基因重组表达载体的构建
• 2.2.2 几丁质酶基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.3 表达蛋白的可溶性分析
• 2.2.4 表达蛋白的几丁质酶活性测定
• 2.3 几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达
• 2.3.1 酵母表达载体的构建和鉴定
• 2.3.2 重组酵母转化子的筛选
• 2.3.2.1 酵母转化子的甲醇利用表型的筛选
• 2.3.2.2 酵母转化子的 PCR 鉴定
• 2.3.2.3 几丁质酶基因多拷贝整合子的筛选
• 2.3.3 几丁质酶基因在Pichia pastoris 中的表达
• 2.3.3.1 几丁质酶基因在 Pichia pastoris 中的胞内表达
• 2.3.3.2 几丁质酶基因在 Pichia pastoris 中的分泌表达
• 2.3.3.3 重组酵母菌株产酶曲线测定
• 2.3.3.4 几丁质酶基因表达产物的 SDS-PAGE 检测
• 2.3.3.4.1 胞内表达重组酵母几丁质酶表达产物的SDS-PAGE 检测
• 2.3.3.4.2 分泌表达重组酵母几丁质酶表达产物的SDS-PAGE 检测
• 3 讨论
• 3.1 实验分析
• 3.2 表达系统的选择
• 3.3 酵母细胞的破壁方法
• 3.4 真核表达载体的线性化
• 第四章 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因分泌表达产物的纯化及其性质研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 几丁质酶工程菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 巴斯德毕赤酵母分泌表达产物的纯化
• 1.2.2 表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
• 1.2.3 几丁质酶酶学特性的研究
• 1.2.3.1 反应最适温度
• 1.2.3.2 热稳定性
• 1.2.3.3 反应最适pH 值
• 1.2.3.4 pH 值稳定性
• 1.2.3.5 各种金属离子对几丁质酶活性的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 重组几丁质酶的纯化
• 2.2 重组几丁质酶的最适反应温度
• 2.3 重组几丁质酶的热稳定性
• 2.4 重组几丁质酶的最适反应pH 值
• 2.5 金属离子对重组几丁质酶活性的影响
• 3 讨论
• 3.1 几丁质酶的热稳定性
• 3.2 几丁质酶酶活的大小
• 3.3 几丁质酶的pH 稳定性
• 第五章 结果和展望
• 1 结果
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢