输卵管囊肿鸡群4种病原调查及IBV流行毒株S1基因变异分析

论文摘要

1.鸡杆菌属（Gallibacterium）是巴氏杆菌科的一个新属,代表种是鸭源鸡杆菌（Gallibacterium anatis）,国外学者已证实鸡杆菌与输卵管炎及输卵管囊肿有一定的关系;王川庆等首次报道了河南省部分发生输卵管囊肿鸡群有较高的鸡杆菌感染率。国外有报道称鸡杆菌经常与产蛋下降综合征病毒（egg drop syndrome,EDS76V）、鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）及鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）等混合感染,而鸡杆菌可能扮演着诱发并加剧其他感染的角色。为了了解国内输卵管囊肿患鸡鸡杆菌感染的情况,并探讨EDS76V、MG和IBV在鸡输卵管囊肿发生过程中所扮演的角色,作者对河南、山西部分输卵管囊肿鸡群及临床健康鸡群进行了上述相关病原感染情况的调查:采集输卵管囊肿鸡群心、肝、脾、肺、气管、输卵管、卵巢和十二指肠,同时采集泄殖腔、上腭裂、喉头和气管棉拭子,样品经血平板划线培养,对疑似鸡杆菌分离物通过定位于16S RNA和23S RNA转录间区序列的特异性PCR扩增鉴定。结果显示:输卵管囊肿鸡群鸡杆菌阳性率41.67%（40/96）,临床健康鸡群鸡杆菌阳性率27.3%（9/33）;棉拭子样品的PCR检测结果显示:所有被检鸡群中仅河南某一鸡场不同批次鸡群个别鸡混合感染有IBV、EDS76V和MG,这一结果初步排除了IBV、MG和EDS76V在这些鸡群输卵管囊肿发生过程中的主要作用,说明鸡杆菌在鸡输卵管囊肿中可能扮演着极为重要的角色,而且临床健康鸡群也存在鸡杆菌的感染,提示人们在防治鸡输卵管囊肿时不可忽视鸡杆菌的作用。2. IBV血清型众多,且各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用,给本病的防治带来很大困难。对IBV流行毒株进行分型对于选择合适疫苗具有重要意义。IBV S1基因是其主要的免疫原基因,该基因全序列分析可为确定流行毒株血清型提供参考。本研究从河南部分疑似传支感染鸡场分离到6株病毒,并对其进行了以下研究:1)病毒接种鸡胚可见胚体上有白色絮状物附着,尿囊膜明显增厚,胚体发育缓慢且有出血斑点;鸡胚尿囊液无直接血凝性;分离物对气管环纤毛有明显的损伤;随着传代次数的增加,孵化至18日龄的鸡胚可见典型侏儒胚变化;病毒核衣壳基因的特异性RT-PCR扩增产物电泳结果为阳性,证实所有分离株均为IBV;2)对上述分离株及参考株YI株、H120疫苗株的S1基因进行了扩增、克隆及序列比较。结果显示8株IBV S1全基因长度分四类,分别是1632bp、1620bp、1617bp和1611bp,序列相互之间存在多位点的变异,同时存在插入和缺失现象;S蛋白裂解位点序列模式有HRRRR、RRFRR和RRSRR三种;同源性分析显示呼吸道型Jin-13株与H120株同源率为97.3%,肾型YI株与ArkDPI11株同源率高达99.8%,腺胃病变型HN/SG株与各毒株同源性仅有79.5%～88.4%;河南肾型分离株HN/HL、XP/1/09、XP/3、WZL株与山东肾型分离株之间的同源性为94.8%～99.1%;遗传进化分析显示YI株与ArkDPI型毒株亲缘关系最近;Jin-13株与H120株亲缘关系较近,HN/HL株、XP/1/09、XP/3、WZL株和山东肾型分离株亲缘关系较近,与河南HN99株亲缘关系较远;而HN/SG株与国内肾型分离株亲缘关系均较远。结果说明河南地区存在不同的IBV流行毒株,而且在S1基因分子水平上发生了明显的变异。3)在上述S1基因全序列分析的基础上,对GenBank上公布的其余21株IBV的S1基因序列进行了分析,找出呼吸型疫苗株和国内肾型流行毒株相对保守的差异序列,据此设计合成两对引物并建立了可以对这两类IBV毒株进行鉴别的反转录-复合PCR。运用该方法对分离的IBV流行毒株和疫苗毒株进行了S1基因部分序列的扩增,结果显示该方法能将我国地方流行的肾型IBV毒株与呼吸型疫苗株完全区分开来,可对本病进行快速分型,为临床上选择合适血清型疫苗提供参考。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 中英文缩写表
• 第一章 文献综述
• 1. 鸡输卵管囊肿及其病因学研究进展
• 1.1 鸡输卵管囊肿的临床表现及其危害
• 1.1.1 流行病学特征
• 1.1.2 临床表现及危害
• 1.2 病因学研究进展
• 1.2.1 国内早期研究概况
• 1.2.2 国外早期研究概况
• 1.2.3 鸡杆菌与输卵管囊肿
• 1.3 结语
• 2. 鸡传染性支气管炎病毒致病性、分型及分子生物学特性研究进展
• 2.1 病毒致病性及分型研究
• 2.1.1 IBV 致病性及临床分型
• 2.1.2 血清学分型
• 2.1.3 基因分型
• 2.2 分子生物学特征
• 2.2.1 基因组特征
• 2.2.2 S基因研究进展
• 2.2.3 遗传变异机制
• 2.3 结语
• 第二章 试验研究
• 76V 的 PCR 检测'>试验一 鸡杆菌阳性鸡群IBV、MG 和EDS₇₆V 的 PCR 检测
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 分析与讨论
• 4 小结
• 试验二 免疫鸡群传染性支气管炎病毒的分离与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 分析与讨论
• 4 小结
• 试验三 6 株鸡传染性支气管炎病毒流行毒株 S1 基因的变异分析
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 分析与讨论
• 4 小结
• 试验四 基于S1 基因的反转录-复合PCR 对肾型与呼吸型IBV 的分型研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 分析与讨论
• 4 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录