F2代筛选法检测新疆棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性基因频率

论文摘要

棉铃虫Helicoverpa armigera Hubner属鳞翅目夜蛾科,是一种世界性的农业害虫。20世纪90年代初,由于棉铃虫抗药性水平突增,导致棉铃虫大面积暴发,并造成了严重的经济损失。Bt棉由于对靶标害虫具有优异防治效果,在全球广泛种植,有效地控制了棉铃虫为害。Bt棉在整个生长发育时期都表达Bt毒素蛋白（Cry1Ac）,对靶标害虫形成巨大选择压力,靶标害虫对Bt棉抗性的演化将成为影响Bt棉使用寿命的限制因素。Bt棉在中国黄河和长江流域棉区已广泛种植多年,Bt棉占棉花总面积90%左右；但在新疆棉区种植面积有限,Bt棉占棉花总面积10%左右。有关黄河流域和长江流域棉区棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性基因频率的检测,已有相关报道；但新疆棉区棉铃虫Cry1Ac抗性基因频率还没有报道。本研究采用F：代筛选法检测了2个新疆棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性基因频率,筛选获得2个棉铃虫Cry1Ac抗性品系,并测定了这2个抗性品系的抗性谱、抗性遗传方式和钙粘蛋白cDNA全长序列。1.新疆棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性等位基因频率的估算采用F2代筛选法检测了2010年采自南疆莎车种群和北疆沙湾棉铃虫种群对Bt毒素Cry1Ac的抗性基因频率。对莎车种群,共筛选了151个单雌系F2后代,其中5个为阳性；对沙湾种群,共筛选了113个单雌系F2后代,其中3个为阳性。经检测和估算,2010年南疆莎车种群和北疆沙湾种群棉铃虫对Cry1Ac的抗性等位基因频率分别为：0.0098和0.0108。2.田间棉铃虫抗性品系抗性谱与抗性遗传方式对F2代筛选获得的阳性单雌系后代用Cry1Ac连续筛选2代,从南疆莎车和北疆沙湾棉铃虫种群中各获得一个抗性品系：SC23和SW34。毒力测定表明,SC23和SW34品系对Cry1Ac活化毒素的抗性倍数分别为22和20倍。SC23抗性品系对Cry1Aa和Cry1Ab分别具有27和20倍的交互抗性,SW34对Cry1Aa和Cry1Ab都具有17倍的交互抗性,两个品系对Cry2Ab均无交互抗性。通过测定抗性品系与敏感品系（SCD）正反交F,种群对Cry1Ac的LC50,结果表明SC23对Cry1Ac抗性为常染色体、不完全隐性遗传,SW34对Cry1Ac抗性为常染色体、不完全显性遗传。3.棉铃虫SC23和SW34抗性品系钙粘蛋白基因的鉴定将SC23和SW34抗性品系分别与SCD-r1（钙粘蛋白基因r1突变纯合品系）、SCD（敏感品系）进行杂交,根据其F,后代对Cry1Ac的敏感性判断抗性等位基因遗传互补情况。SC23和SW34品系在钙粘蛋白位点与敏感品系表现为遗传互补,而与SCD-r1品系不能遗传互补；该结果表明SC23和SW34抗性品系对Cry1Ac的抗性均与钙粘蛋白等位基因的变异相关。因此,对这两个抗性品系的钙粘蛋白基因全长cDNA进行了克隆和测序。结果发现SC23和SW34钙粘蛋白基因编码的氨基酸序列与敏感品系相比长度不变,氨基酸序列存在多个多态性位点。因此,SC23和SW34抗性品系的钙粘蛋白可能通过氨基酸替换导致对Cry1Ac产生抗性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 BT毒素
• 1.1 Bt毒素的来源与分类命名
• 1.2 Bt毒素的结构
• 1.3 Bt毒素的杀虫活性
• 2 BT毒素的作用机理
• 2.1 作用机理
• 2.1.1 原毒素的溶解与活化
• 2.1.2 毒素穿孔模型
• 2.1.3 信号转导模型
• 2.2 毒素在昆虫体内的结合受体
• 2.2.1 Cadherin类受体
• 2.2.2 APN类受体
• 3 害虫BT抗性的检测方法
• 3.1 传统剂量反应法（Dose-response bioassay）
• 3.2 区分剂量法（Diagnostic dose bioassay）
• 1代筛选法（F₁ screen）'>3.3 F₁代筛选法（F₁screen）
• 2代筛选法（F₂ screen）'>3.4 F₂代筛选法（F₂screen）
• 3.5 抗性基因分子检测法（Molecular detection of resistant genes ）
• 4 害虫的抗性遗传方式
• 4.1 害虫对Bt抗性的显性水平
• 4.1.1 害虫对Bt抗性显性水平的评估
• 4.1.2 害虫对Bt抗性的显性水平的可变性
• 4.2 抗性是否为性连锁遗传或是否具有母体效应
• 4.3 抗性涉及的基因数目
• 5 抗性治理策略
• 5.1 高剂量/庇护所
• 5.2 基因策略
• 5.3 抗性监测
• 6 本研究的目的及意义
• 第二章 棉铃虫田间种群CRY1AC抗性基因频率的估算
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 供试昆虫
• 1.1.2 主要试剂
• 2代原理'>1.2 单雌系F₂代原理
• 1.3 试验方法
• 1.4 抗性等位基因频率的计算方法
• 2 结果与分析
• 2.1 南疆莎车县田间棉铃虫种群抗性基因频率检测结果
• 2.2 北疆沙湾县田间棉铃虫种群抗性基因频率监测结果
• 3 讨论
• 第三章 田间棉铃虫抗性品系抗性谱和抗性遗传方式及钙粘蛋白突变的鉴定
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 抗性遗传方式的研究
• 3 棉铃虫钙粘蛋白cDNA全长的克隆
• 3.1 中肠总RNA的提取
• 3.1.1 SV试剂盒提取法
• 3.1.2 Trizol提取法
• 3.2 RNA质量的检测
• 3.2.1 琼脂糖电泳检测RNA质量的完整性
• 3.2.2 检测RNA质量的浓度以及其他指标
• 3.2.3 cDNA模板的合成
• 3.3 基因组DNA的提取
• 3.4 PCR引物设计
• 3.5 PCR反应
• 3.6 PCR产物的回收纯化、克隆及序列测定
• 3.6.1 PCR产物的回收
• 3.6.2 连接反应
• 3.6.3 转化大肠杆菌
• 4 结果和分析
• 4.1 抗性品系的纯化及抗性遗传方式与抗性谱
• 4.2 南疆SC23钙粘蛋白基因cDNA的克隆及序列比对
• 4.3 北疆SW34钙粘蛋白基因cDNA的克隆及序列比对
• 5 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢