论文摘要
哺乳动物牙根发育是一个长期的过程,包括:牙根发育启动、牙根延长并建立牙周附着关系、牙齿萌出直至咬合关系建立、最后牙根发育完成、根尖孔闭合。在人类,牙根发育持续至牙齿萌出后的3-5年。然而,目前大量相关研究集中在牙根发育的启动阶段,对于牙根启动后至发育完成这一长期而复杂的过程的研究非常少。然而在这一过程中,牙根进一步发育同时伴有牙周组织形成及牙周附着的建立,从而使牙根及牙周组织形成一个功能单位被锚定在颌骨上。因此,对于牙根发育启动后至发育完成这一时期的研究,特别是对牙根及牙周组织共同发育机制的探讨是非常必要的。牙根及牙周组织共同的发育依赖于发育期牙根的根端组织持续增殖并分化。在结构上,发育期牙根的根端组织包含双层上皮细胞构成的鞘样结构,即Hertwig上皮根鞘（Hertwig’s epithelial root sheath,HERS）。上皮根鞘将其下方的外胚间充质组织划分为牙乳头及牙囊,牙乳头形成根部牙本质及牙髓,牙囊则形成牙周组织。尽管这个区域的细胞在构成上具有异质性的特征,然而,存在于这三种成分间的相互作用及各自的功能对于建立结构完整的牙根/牙周复合体是必须的。因此,发育期牙根的根端组织似乎成为一个发育上的复合体,这个复合体由多种相互作用,密切相关的细胞类型构成的,我们将其命名为发育期牙根的根端复合体（developing apical complex,DAC）。本课题旨在通过对大鼠磨牙牙根发育期根端复合体-DAC的组织学及细胞学观察,探讨DAC在原位的组织学特征,以及体外分离、培养的DAC细胞的生物学特性,并进一步将DAC组织与细胞分别进行同种异体大鼠肾被膜下移植,明确DAC在体内是否具有继续发育能力,以及分化成为牙根/牙周组织形成细胞并在体内形成牙根及牙周组织的能力,并初步探讨了HERS在牙根及牙周组织共同发育中的作用。最后,我们还比较了DAC与牙根发育早期及牙根发育完成期根端组织的组织学、细胞学及成牙能力的差异,以明确DAC在发育学上的特征。第一部分大鼠磨牙牙根发育期根端复合体-DAC在原位的组织学观察实验一、采用组织学方法系统观察了牙根发育早期（PN8d）,发育期（PN21d）及发育完成期（PN35d）,SD大鼠下颌第一磨牙牙根发育过程中根端组织的组织学特征。同时应用免疫组织化学方法观察了牙根发育不同时期,HERS的形态学特征。结果表明: PN8d时,SD大鼠下颌第一磨牙HERS开始形成,牙根发育启动;牙囊包绕成釉器与牙乳头。此时的根端组织包括牙乳头、HERS及部分牙囊。牙囊与牙乳头间有明确的组织学界限。PN21d时,牙根发育接近一半,HERS在根旁已经断裂,然而在牙本质根尖末端及上皮隔的部位仍然保持完整。此时牙囊仅存在于发育期牙根的根端,与牙乳头相连,两种组织间失去了牙根启动时存在的明确的组织学界限,而成为一个组织结构上的整体,因此将其命名为发育期根端复合体。PN35d时,HERS完全断裂并消失,牙根发育完成。实验二、采用组织学及免疫组织化学方法检测了发育期牙根的根端复合体-DAC在原位的组织学特征。结果发现:DAC呈现出细胞浓聚的现象,这种细胞浓聚有利于细胞-细胞,细胞-基质间相互作用,从而有利于组织形态发生;DAC包含大量具有高增殖活性的未分化间充质前体/干细胞,提示DAC较其邻近的成体牙髓组织（dental pulp, DP）具有更为“胚胎性”的特征;DAC表达多种牙本质,骨/牙骨质相关的矿化蛋白,提示DAC细胞不仅具有成牙本质细胞向分化的潜力,同时也具有成骨/成牙骨质向分化的潜力。第二部分DAC细胞分离、培养和生物学特性的初步研究实验一、采用显微机械法分离了PN21d龄SD大鼠下颌第一磨牙根端复合体-DAC,并使用抗CK-14免疫组化染色观察离体的DAC组织中是否包含HERS结构。并采用酶消化法分离培养了原代DAC细胞及牙髓细胞（dental pulp cells, DP细胞）。结果发现:离体的DAC组织包含结构完整的HERS及间充质组织,表明本实验使用的分离方法能够完整分离DAC组织;原代培养的DAC细胞包含典型的上皮样细胞及间充质样细胞。间充质样细胞接种后迅速贴壁,伸展后呈长梭形或三角形。上皮样细胞呈多角形,细胞连接紧密,聚集在一起呈克隆样生长,细胞排列成铺路石样。间充质样细胞分散在上皮样细胞团周围,使上皮样细胞呈“岛”样分布。原代培养的牙髓细胞均为间充质样细胞,细胞形态为长梭形或三角形,未见上皮样细胞存在。实验二、采用细胞计数、BrdU掺入增殖细胞及流式细胞仪检测细胞周期分布等方法,检测了DAC细胞在体外的增殖能力,并与牙髓细胞-DP的增殖能力作了对比分析,从而明确DAC细胞在体外的增殖特性以及发育期组织与成体组织细胞间增殖能力的差异。结果表明:DAC细胞的增殖能力显著高于成体牙髓细胞,相比较,几乎全部的牙髓细胞都处于静息状态。提示发育期组织来源的细胞较之成体细胞具有更高的增殖能力;此外,DAC作为成体环境中的发育期组织,具有“胚胎性”组织的特征。实验三、采用ALP活性检测、矿化结节染色及RT-PCR检测矿化相关基因表达的方法,检测了原代培养的DAC细胞在体外的矿化及分化能力。使用牙髓细胞-DP作为对照,分析了发育期组织与成体组织细胞间矿化及分化能力的差异。结果表明:DAC细胞在体外显示了较牙髓细胞更高的矿化能力。并且高表达成牙本质细胞、成牙骨质/成骨细胞的标志基因,提示DAC细胞不同于牙髓细胞,不仅存在成牙本质细胞向的分化,也存在成骨/成牙骨质细胞向的分化。第三部分DAC组织及细胞的体内种植研究及HERS作用的探讨实验一、将离体的完整DAC组织与牙髓组织分别进行了同种异体大鼠肾被膜下移植,以明确DAC组织在体内是否具有独立发育能力,并且能够重现有序的牙根及牙周组织形态发生。结果表明:DAC组织移植物在异位环境中重现了正确的牙根及牙周组织形态发生,形成了结构完整的,包含牙本质、牙骨质、牙周膜及骨样组织的牙根-牙周复合体样结构。提示DAC组织在异位环境下能够继续发育,并发育成为形态正确的牙根及牙周组织。牙髓组织移植物仅发育成为不规则的牙本质/牙髓复合体样结构。实验二、将原代DAC细胞进行反复差别消化培养,获得了纯化的上皮细胞（HERS）及间充质DAC细胞,经Western blot鉴定排除了上皮与间充质细胞间的污染,并将包含HERS细胞的DACCs（HERS+间充质细胞混合培养）与不包含HERS细胞的DACCs-M（仅间充质细胞）,分别与陶瓷化牛骨（ceramic bovine bone, CBB）复合后进行同种异体大鼠肾被膜下移植,以探讨HERS在牙根及牙周组织发育中的作用。结果表明:包含HERS细胞的DACCs移植物形成了形态良好的牙根及牙周组织样的结构,包括牙本质、牙骨质、牙周膜及骨样组织。然而,去除了HERS细胞的DACCs-M移植物仅形成了没有牙本质小管结构的骨样牙本质,以及无规则排列的纤维样组织。提示HERS在牙根及牙周组织发育中起重要的作用,同时也揭示了DAC作为一个功能性的整体在牙根及牙周组织共同发育中起作用,而DAC中每一种细胞成分对于牙根-牙周复合体的形成都是必需的。第四部分DAC与牙根启动期及完成期根端组织的对比研究实验一、采用显微机械分离、酶消化法原代培养了DAC细胞（PN21d）及牙根发育启动期（PN8d）、发育完成期（PN35d）的根端组织细胞,并采用细胞计数、流式细胞仪检测细胞周期分布、ALP活性检测、矿化结节染色及RT-PCR基因表达检测等方法对比了DAC细胞与牙根启动期、完成期根端组织细胞,在体外细胞增殖、矿化及分化能力上的差异。结果表明:DAC细胞具有类似于牙根启动期根端组织细胞的极高的细胞增殖能力;其矿化能力较牙根启动期的根端组织细胞更高。并且这两个时期矿化相关蛋白mRNA的表达也存在差异,DAC细胞不仅表达牙根-牙周组织前体细胞的标志分子,还表达分化成熟的牙根-牙周组织形成细胞的标志分子。提示DAC中不仅存在形成牙根及牙周组织的前体细胞群,还包含分化成熟的牙根/牙周组织形成细胞。然而,DAC细胞在体外的极高的发育潜力在牙根发育完成期的根端组织细胞中不存在。实验二、将原代培养的DAC细胞、牙根启动期及完成期根端组织细胞分别与CBB复合后进行同种异体大鼠肾被膜下移植,以探讨DAC细胞与牙根启动期、完成期根端组织细胞在体内分化能力及形成牙根-牙周组织能力的差异。结果表明:DAC及牙根启动期根端组织细胞在体内均能形成形态规则的牙根-牙周组织样结构,而完成期的根端组织细胞没有形成牙根-牙周组织的能力。提示DAC细胞类似于牙根发育早期的根端组织细胞,不仅包含牙根及牙周组织形成所需要的所有的前体细胞,也包含正确的牙根/牙周组织形态发生所必需的成牙的微环境。