温度胁迫下番茄叶绿体谷胱甘肽还原酶基因的克隆、表达和功能分析

论文摘要

低温是限制冷敏感植物产量和地理分布的重要因素。在正常生长条件下,植物细胞的多种代谢反应均会产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）。而低温、高温、盐渍、干旱、臭氧等胁迫则可导致ROS大量产生,若未及时清除,ROS便会攻击蛋白质、核酸、脂类等生物大分子引起氧化损伤,进而导致细胞及组织死亡。植物叶绿体是ROS产生的主要部位之一,环境胁迫下叶绿体内产生的ROS的快速清除有助于保护光合机构,维持植物光合功能。谷胱甘肽（glutathione, GSH）是叶绿体活性氧清除系统的关键组分,GSH既可以直接与ROS反应将其还原,又可以作为底物参与酶促反应以清除活性氧。谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, GR）维持着GSH较高的还原型/氧化型的比率,这对于清除细胞内ROS至关重要。因此,研究GR基因与植物抗逆性的关系具有重要意义。本研究从番茄叶片中克隆了叶绿体谷胱甘肽还原酶基因（LeGR）,并对该基因的表达和功能进行了分析。1.利用同源序列设计兼并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到叶绿体GR基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’片段和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。命名为LeGR（EU285581）。该基因全长为2229 bp,ORF为1674 bp,编码557个氨基酸,分子量约为59 kDa。同源序列比较表明,番茄谷胱甘肽还原酶基因的序列与烟草、拟南芥、水稻、豌豆、油菜的谷胱甘肽还原酶基因的序列同源性较高。2.将p35S-LeGR-GFP融合蛋白在拟南芥原生质体中瞬时表达。通过Confocal观察到GFP激发的绿色荧光和叶绿素的红色自发荧光完全重合,说明LeGR基因产物定位于叶绿体。3. Northern杂交分析表明,LeGR基因在叶绿素含量高的组织中表达量较高。同时该基因的表达受低温、高温胁迫诱导,其表达水平随胁迫处理时间的延长而变化。4. LeGR基因组序列全长6672bp,共有10个exon。Southern杂交结果表明, LeGR在番茄基因组中只有一个拷贝。5.将获得的LeGR基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,用PCR及Northern杂交的方法对带卡那抗性的转基因番茄植株进一步检测,结果证明成功地获得了转正义和反义基因的番茄植株。与野生型相比,转反义LeGR基因的番茄叶片GR活性下降约60%。6.构建了原核表达载体pET-LeGR,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,将诱导带切下,溶于PBS获得抗原,免疫小白鼠,其抗血清效价为1: 500。Western杂交表明,反义基因植株中LeGR基因在蛋白水平的表达明显受到抑制。7.在低温弱光（4℃,100μmol m-2 s-1）和高温（40℃）胁迫条件下,野生型和转基因株系的净光合速率（Pn）和PSII最大光化学效率（Fv/Fm）下降,但与野生型相比,转反义基因株系T1（-2）T1-5和T1-9的下降更为明显。这表明抑制LeGR的表达加剧了PSII的光抑制。在低温弱光处理过程中,转基因植株与野生型的氧化态P700降低,恢复24 h后,转反义基因三个株系分别恢复到原来的70.2%、72.9%和69.8%。经过24 h处理,转基因和野生型的H2O2和丙二醛含量均增加,转反义基因植株显著高于野生型。8.正常生长条件下,野生型与转反义基因幼苗生长量无明显差别。但是,温度胁迫条件下,转反义基因幼苗生长明显受到抑制,且叶绿素含量显著下降。9.转基因植株中GR活性明显降低,抑制了谷胱甘肽循环周转,导致GSH/GSSG比率降低,但谷胱甘肽总量不变;谷胱甘肽循环周转的降低导致抗坏血酸周转受到抑制,AsA/DHA比率降低,且抗坏血酸总量明显降低。AsA-Glu循环受阻导致的H2O2积累是光抑制和冷敏感性增加的主要原因。另外,APX和SOD活性受到直接或间接的影响,进一步加剧了光抑制。

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1 前言

1.1 植物体内活性氧与其清除系统

1.2 低温胁迫对植物的影响

1.3 高温胁迫对植物的影响

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 材料处理

2.1.3 菌株与质粒

2.1.4 酶及生化试剂

2.1.5 PCR 引物

2.2 实验方法

2.2.1 总RNA的提取

2.2.2 cDNA 第一条链的合成

2.2.3 cDNA纯化

2.2.4 对cDNA进行末端加尾

2.2.5 番茄叶绿体谷胱甘肽还原酶基因全长的克隆

2.2.6 Northern杂交分析

2.2.7 真核表达载体的构建

2.2.8 转基因番茄植株的PCR检测

2.2.9 叶绿体谷胱甘肽还原酶的原核表达及Western杂交

2.2.10 谷胱甘肽还原酶的叶绿体定位

2.2.11 转基因番茄生理指标的测定

2.2.12 Southern 杂交分析

3 结果与分析

3.1 LeGR基因的分离及其特征

3.1.1 LeGR基因全长的克隆

3.1.2 LeGR基因的序列分析

3.1.3 LeGR-GFP 融合蛋白的亚细胞定位

3.1.4 LeGR基因在番茄中的表达分析

3.1.5 LeGR基因在番茄基因组中的存在形式

3.1.6 LeGR基因在大肠杆菌中的表达

3.2 LeGR基因在番茄中的遗传转化

3.2.1 正、反义表达载体的构建

3.2.2 转LeGR基因植株的鉴定

3.3 转反义 LeGR 基因对温度胁迫下抗氧化酶活性的影响

3.3.1 转反义LeGR基因对低温下GR、APX和SOD酶活性的影响

3.3.2 转反义LeGR基因对高温下GR、APX和SOD酶活性的影响

3.4 转反义LeGR基因增加了番茄对低温胁迫的敏感性

3.4.1 转反义LeGR基因对低温下AsA-Glu循环组分的影响

3.4.2 转反义LeGR基因减少了温度胁迫下植株的生长量

3.4.3 LeGR基因表达的抑制增加了低温番茄的光抑制

3.5 LeGR基因表达的抑制增加了番茄的高温敏感性

3.5.1 LeGR基因表达的抑制对高温胁迫下光合速率的影响

3.5.2 LeGR基因表达的抑制增加高温胁迫下PSII的光抑制

3.5.3 转反义LeGR基因对高温下H202、MDA含量的影响

4 讨论

4.1 LeGR基因编码一种叶绿体型谷胱甘肽还原酶

4.2 LeGR基因表达的抑制增加了番茄对温度胁迫的敏感性

4.3 Glu代谢对环境胁迫具有复杂的应答机制

4.4 Glu代谢在植物对环境胁迫的应答中的地位

5 结论

参考文献

致谢

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