肝衰竭时肝细胞高迁移率族蛋白1的移位及释放研究

论文摘要

研究背景:肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症,在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎,其中最主要的是乙肝病毒（hepatitis Bvirus,HBV）感染。而高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1protein,HMGB1）在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质,已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞HMGB1的移位及释放情况。目的:（1）研究LPS或TNF-α刺激是否可引起肝细胞HMGB1的移位及释放,检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌;（2）研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞HMGB1移位;（3）研究D-GalN+LPS诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞HMGB1移位;（4）初步探讨肝细胞HMGB1移位及释放的可能机制。方法:（1）体外用不同浓度LPS或TNF-α刺激肝细胞系HepG2细胞,不同时间点分别收集细胞和培养上清。MTT法测定细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡率,同时测定培养上清中的LDH含量,以明确细胞是否凋亡或坏死。Western blotting方法检测培养上清,细胞核和细胞浆组分蛋白中HMGB1的含量,免疫荧光技术观察HMGB1移位。ELISA,细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。（2）分别收集慢性重型乙型肝炎,慢性乙型肝炎患者及正常肝组织,免疫组织化学染色观察HMGB1在肝细胞中的分布情况。同时行HE染色,评估肝组织的病理学改变。（3）D-GalN联合LPS腹腔注射,诱导小鼠急性肝衰竭模型,同时设置生理盐水对照组。于D-GalN+LPS注射后3h处死动物,收集肝脏组织,进行HMGB1的免疫组织化学染色。（4）用Western blotting和免疫荧光技术,分别观察来普霉素B（LMB）和曲古霉素（TSA）对LPS诱导的肝细胞HMGB1移位和释放的影响。结果:（1）体外用LPS或TNF-α刺激可诱导HepG2细胞释放HMGB1,释放到上清中的HMGB1量随着作用时间延长而增高,20h时达到峰值,免疫荧光观察到HepG2细胞胞核中的HMGB1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内,LPS（≤400ng/mL）或TNF-α（≤25ng/mL）诱导的HMGB1分泌量随LPS或TNF-α剂量增加而增加。MTT,TUNEL检测及上清中LDH含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白Western blotting分析亦证实了细胞浆中的HMGB1表达增强。ELISA和细胞因子抗体芯片检测表明LPS,TNF-α或重组HMGB1刺激HepG2细胞24h,仅见个别其他细胞因子的释放。（2）慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的HMGB1的移位,移位率约为32.84%±7.13%。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中,肝细胞HMGB1集中分布于细胞核中,未见明显的移位。（3）D-GalN+LPS注射后3h,发生移位的肝细胞百分率为:27.42%±4.99%。移位率与生理盐水对照组比较,显著为高（P＜0.01）。（4）体外CRM1抑制剂LMB可以显著减少LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的释放,及HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可以促进LPS诱导的HMGB1释放,促进HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。结论:（1）LPS或TNF-α可时间及剂量依赖性诱导体外培养的HepG2细胞核蛋白HMGB1的移位及释放。（2）慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在HMGB1从细胞核向胞浆的移位,而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。（3）D-Gal+LPS诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞HMGB1存在从细胞核向胞浆的移位。（4）LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的移位和释放可能存在CRM1依赖的核转运,可能与乙酰化相关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英汉缩略语名词对照表
• 前言
• 第一章 LPS或TNF-α诱导肝细胞HMGB1移位及释放研究
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 第二章 慢性重型乙型肝炎病人肝细胞HMGB1移位研究
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第三章 实验性肝损伤小鼠肝细胞HMGB1移位研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 第四章 对肝细胞释放HMGB1机制的初步探讨
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 总结论
• 参考文献
• 综述: HMGB1:内源性危险信号
• 致谢
• 攻读学位期间发表的文章