植物源杀线虫剂的研制及其作用机理的研究

论文摘要

植物根结线虫病是一种土传病害,病原线虫分布广、寄主多,为害严重,已成为制约保护地农业生产的瓶颈。迄今为止,根结线虫的防治主要以化学药剂为主。随着人们对化学药剂危害性的认识及环保意识的增强,一些有效的杀线虫的应用受到了限制,寻求更多新的、对环境友好的替代品已成为从农业生产发展的需要。植物可以看作是自然化学品和生物活性物质的宝库。植物产生各种各样的防卫化合物,用于保护自身免受害虫的取食为害和病原菌的侵染。植物化合物是一种选择性好、低毒、可生物降解的天然产品,从植物中筛选、分离杀虫活性成分,符合人类发展“环境和谐-相容”现代农药的迫切要求。目前,植物在植物寄生线虫防治中应用进展缓慢,亟待挖掘和应用高效杀线虫植物以提高其对线虫的防效。基于此,本文主要开展了对以下研究内容。（1）采用形态观察及鉴别寄主法,对河南省根结线虫病发生严重的保护地蔬菜产区主要作物（番茄、茄子）的根结线虫病原种类进行了鉴定,结果表明:南方根结线虫是河南保护地蔬菜田的绝对优势种,病样检出率高达100%。这一研究确定了河南省保护地蔬菜产区主要根结线虫优势种类,为根结线虫的有效防治奠定理论基础。（2）就18种不受（少受）根结线虫为害的栽培种或野生种作物及具有杀虫活性的药用植物对南方根结线虫的生物活性进行了筛选与验证,筛选出B.B.的生物活性较高,其对J2杀虫活性高于除大豆荚壳外的其它植物,对线虫虫卵孵化的抑制率在处理时间内均大于50%;进一步通过液-液分配萃取、柱层析分离和薄层层析检测对B.B.的生物活性成份进行追踪,得到三种杀线虫生物活性成分,通过核磁共振、气-质联用和液-质联用对杀线虫生物活性成分的结构进行检测,鉴定出全部为生物碱类化合物,分别为A、B、C。其处理72h对线虫J2的校正死亡率分别为59.67%、52.63%和41.87%;处理9d对虫卵的孵化抑制分别为73.43%、59.23%、52.86%。从杀虫植物中分离和纯化活性化合物并进一步鉴定其化学结构,可为人工合成天然植物产品类似物的杀虫农药提供理论依据。（3）从线虫的生理代谢水平及与代谢有关的酶系两方面,就三种杀线虫生物活性植物源成分对线虫作用机理的初步研究。结果表明:三种活性成分可能阻碍了虫体的新陈代谢,并抑制线虫GST和CAT活性,导使线虫体内氧化和抗氧化作用失衡,细胞的功能受到影响,最终导致线虫死亡。另外,三种活性成分可能影响线虫虫体角质层的形成,导致虫体内含物外渗,也是导致线虫死亡一个原因。综合考虑几种植物活性成分对线虫的毒性效果,活性成分A的毒性高于其它两种。从毒理方面证明了B.B.对线虫的毒杀作用及杀虫活性成分的协同作用,为B.B.植物活性成分的开发提供参考依据。（4）试验中设计和验证了一套改进提取装置,并采用响应面分析法对B.B.中总生物碱提取条件进行了优化。结果表明:该装置适应于B.B.生物碱的提取,提取量为8.47 mg·g-1,显著高于供试的其它两种提取方法,溶剂的回收率可达87.67%;B.B.总生物碱的提取条件定为:提取温度为57.8℃,提取时间为13.2h,乙醇浓度为75.2%,此条件下B.B.总生物碱的提取产量为9.63 mg·g-1,与理论值较为接近,表明响应面的优化结果与实际值相吻合,具有一定的实用价值。从而为B.B.生物活性物质在农业、医药、食品等方面的开发提供理论参数。（5）采用直接利用的方式,以B.B.根皮粉和根提取物为原料,将其加工成可湿性粉剂和乳油,并对其进行了理化的测试、室内生测和田间药效试验。结果表明:B.B.乳油的最佳配方为:浸膏（20%）+溶剂a（50%）+溶剂b（10%）+溶剂c（5%）+乳化剂d （10%）+乳化剂e （5%）,其对线虫和虫卵的LC50分别为2 118.43 mg/L、2 090.18 mg/L;B.B.可湿性粉剂的最佳配方为:根粉（77.5%）+表面活性剂a（2%）+表面活性剂b（2.5%）+表面活性剂c（2%）+表面活性剂d（4%）+载体e（12%）。其对线虫和虫卵的LC50分别为2 113.43 mg/L、1 799.98 mg/L。盆栽试验和田间药效试验结果表明:B.B.可湿性粉剂和乳油稀释400倍以下对根结线虫的防治效果都在60%以上,且能促进番茄植株的生长。相同的稀释倍数下,B.B.可湿性粉剂的防治效果略高于乳油。这一研究为B.B.这一植物源杀虫剂商品化的开发和利用提供了理论基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 绪论
• 1.1 植物根结线虫的发生、危害和防治
• 1.1.1 根结线虫的发生规律
• 1.1.2 根结线虫的为害特点
• 1.1.3 植物根结线虫的防治
• 1.2 杀线植物及其在线虫防治中的应用
• 1.2.1 杀线植物种类
• 1.2.2 杀线植物活性成分
• 1.2.2.1 生物碱类
• 1.2.2.2 萜烯类
• 1.2.2.3 番荔枝内酯类
• 1.2.3 杀线植物的应用
• 1.2.3.1 国外应用概况
• 1.2.3.2 国内应用概况
• 1.3 杀线虫植物研究方法
• 1.3.1 植物提取物的制备
• 1.3.1.1 植物水溶性提取物的制备
• 1.3.1.2 植物酯溶性提取物的制备
• 1.3.2 植物提取物杀线虫活性测定
• 1.3.2.1 体外活性试验
• 1.3.2.2 体内活性试验
• 1.4 植物杀（抑）线虫的作用方式及生理机理
• 1.4.1 植物杀（抑）线虫的作用方式
• 1.4.1.1 毒杀作用
• 1.4.1.2 拒食和忌避作用
• 1.4.1.3 干扰正常的生长发育作用
• 1.4.1.4 光活化毒杀作用
• 1.4.2 植物杀（抑）线虫的生理机理
• 1.4.2.1 对线虫体内不同酶系的作用
• 1.4.2.2 对线虫体内代谢反应的作用
• 1.5 植物源杀线剂农药的开发及应用
• 1.5.1 植物源农药的概念
• 1.5.2 植物源杀虫（线）剂的开发利用
• 1.5.2.1 直接开发利用
• 1.5.2.2 间接开发利用
• 1.5.3 植物源杀虫剂的制剂化研究
• 1.6 展望
• 1.7 研究课题的确立与总体研究思路
• 1.7.1 研究的意义
• 1.7.2 研究的总体思路
• 1.7.3 研究的技术路线
• 第二章 河南省保护地根结线虫优势种类的鉴别
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 根结线虫的采集
• 2.1.2 线虫种群保存
• 2.1.3 线虫的分离与纯化培养
• 2.1.4 种类鉴定
• 2.1.4.1 形态观察
• 2.1.4.2 鉴别寄主试验
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 形态观察结果
• 2.2.1.1 会阴花纹
• 2.2.1.2 其它形态
• 2.2.2 鉴别寄主试验结果
• 2.2.3 对寄主的为害症状
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 植物源杀线虫活性成分的分离纯化及检测
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 植物材料
• 3.1.1.2 供试线虫的扩大培养
• 3.1.1.3 主要试剂及仪器设备
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 初筛植物粗提物的提取
• 3.1.2.2 植物提物液杀线虫生物活性的测定
• 3.1.2.3 植物活性成分的初步分离
• 3.1.2.4 植物活性成分的进一步分离
• 3.1.2.5 化合物活性成分的检测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 植物材料提取物杀线虫生物活性的筛选
• 3.2.1.1 室内毒杀活性的测定结果
• 3.2.1.2 室内虫卵孵化抑制率的测定结果
• 3.2.2 杀线虫活性成分的初步分离及测定结果
• 3.2.2.1 不同溶剂萃取物对J2 毒杀活性的测定结果
• 3.2.2.2 不同溶剂萃取物对虫卵孵化抑制率的测定结果
• 3.2.3 杀线虫活性成分的柱层析分离及测定结果
• 3.2.3.1 活性成分的柱层析分离结果
• 3.2.3.2 不同组分对J2 毒杀活性的测定结果
• 3.2.3.3 不同组分虫卵孵化抑制率的测定结果
• 3.2.4 杀线虫活性成分的TLC 分离及测定结果
• 3.2.4.1 不同活性成分对J2 毒杀活性的测定结果
• 3.2.4.2 不同活性成分对虫卵孵化抑制率的测定结果
• 3.2.5 化合物活性成分结构的检测结果
• 3.3 结论与讨论
• 3.3.1 结论
• 3.3.2 讨论
• 第四章 植物活性成分杀线机理的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 中毒症状的观察
• 4.1.2.2 供试线虫的处理方法
• 4.1.2.3 虫体蛋白含量的测定
• 4.1.2.4 虫体总糖含量的测定
• 4.1.2.5 虫体谷胱甘肽还硫酶（GST）活性测定
• 4.1.2.6 虫体过氧化氢酶（CAT）活性测定
• 4.1.2.7 虫体酯同工酶含量的测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 中毒症状
• 4.2.2 对蛋白质（pro）含量的影响
• 4.2.3 对总糖含量的影响
• 4.2.4 对谷胱甘肽还硫酶（GST）活性的影响
• 4.2.5 对过氧化氢酶（CAT）活性的影响
• 4.2.6 对酯同工酶（EST）的影响
• 4.3 结论与讨论
• 4.3.1 结论
• 4.3.2 讨论
• 第五章 B.B.总生物碱提取工艺的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料与设备
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 改良提取装置的设计
• 5.1.2.2 总生物碱的提取
• 5.1.2.3 总生物碱提取量的测定
• 5.1.2.4 不同提取溶剂的影响
• 5.1.2.5 提取条件的单因素试验
• 5.1.2.6 提取条件的响应面试验
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 不同提取方法对总生物碱的提取效果
• 5.2.2 不同溶剂对总生物碱提取效果的影响
• 5.2.3 单因素试验
• 5.2.3.1 温度对总生物碱提取效果的影响
• 5.2.3.2 提取时间对总生物碱提取效果的影响
• 5.2.3.3 乙醇浓度对生物碱提取效果的影响
• 5.2.3.4 液料比对生物碱提取效果的影响
• 5.2.4 响应面分析试验结果
• 5.2.5 B.B.总生物碱提取效果响应面优化
• 5.2.6 响应面分析结果的验证试验
• 5.3 结论与讨论
• 5.3.1 结论
• 5.3.2 讨论
• 第六章 植物源杀线虫剂的研制与应用
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.1.1 供试样品
• 6.1.1.2 供试药剂
• 6.1.2 试验方法
• 6.1.2.1 B.B.乳油的研制方法
• 6.1.2.2 B.B.可湿性粉剂的研制方法
• 6.1.2.3 B.B.乳油和可湿性粉剂对根结线虫室内毒力测定
• 6.1.2.4 B.B.乳油和可湿性粉剂的应用
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 B.B.乳油的研制
• 6.2.1.1 B.B.乳油溶剂的选择结果
• 6.2.1.2 B.B.乳化剂的选择结果
• 6.2.1.3 B.B.浸膏含量的确定结果
• 6.2.1.4 乳油配方确定
• 6.2.1.5 乳油质量的检测结果
• 6.2.2 B.B.可湿性粉剂的研制方法
• 6.2.2.1 B.B.可湿性粉剂表面活性剂的筛选
• 6.2.2.2 载体的筛选
• 6.2.2.3 可湿性粉剂根粉含量的确定
• 6.2.2.4 可湿性粉剂质量检测结果
• 6.2.3 B.B.乳油和可湿性粉剂室内生物活性测定结果
• 6.2.4 B.B.乳油和可湿性粉剂应用
• 6.2.4.1 盆栽试验
• 6.2.4.2 田间药效试验
• 6.3 结论与讨论
• 6.3.1 结论
• 6.3.2 讨论
• 6.3.2.1 B.B.制剂合适剂型的选择
• 6.3.2.2 有效成分含量的确定
• 6.3.2.3 B.B.复方制剂的配制
• 第七章 结论与建议
• 7.1 结论
• 7.2 建议
• 参考文献
• ABSTRACT
• 缩略词及中英文对照表
• 攻读博士学位期间发表论文题录