猪流感病毒抗体水平监测、神经氨酸酶基因的克隆与原核表达载体初步的构建

论文摘要

为了解广西猪群中猪流感病毒抗体水平,本调查主要采用血球凝集抑制（HI）试验和ELISA相结合的血清学方法,从广西10个市11个规模种猪场（均未进行SIV免疫）采集种公猪、后备母猪和经产母猪399份血清,从小型猪场和散养户采集不同年龄阶段猪的血清291份,进行了H1和H3亚型猪流感病毒的抗体检测。用HI方法和ELISA对344份进行了检测,结果表明:HI方法检测出阳性为175份,阳性率分别为50.87%（175/344）;ELISA法检测出阳性为195份,阳性率分别为56.68%（195/344）;HI方法与ELISA方法的符合率达到89.74%（175/195）,但两种检测方法检出率差异不显著（P＞0.05）;说明改良的HI试验作为检测方法,可以用于监测非免疫猪群的流感病毒感染情况。11个规模种猪场均受到不同程度的H1和H3亚型SIV感染,H1、H3和H1+H3亚型流感病毒抗体平均阳性率为60.5%、42%和21.65%;而其它小型猪场和散养户猪血清的H1、H3和H1+H3亚型流感病毒抗体阳性率相对较低,别为31.31%、34.34%、7.1%。2006至2007年,本实验同时在全区14个市130个疑似猪流感病毒（SIV）感染的发病猪采集251份组织病料（肺、脾、淋巴结）和在4个市8个猪场采集155份病料棉拭子,提取RNA,用核蛋白（NP）引物进行RT-PCR检测SIV,将检出阳性病料,结果:在251份和155份中分别检测出72份和11份为阳性。由于上述猪场的未使用SIV疫苗的免疫,因此,这些抗体只能理解是由野毒株感染产生的。这就表明目前,广西猪群中普遍受H1和H3亚型SIV感染,因此我们要严密监视流感病毒在猪群中的发展动向,防止流感的大流行。本研究同时对神经酸酶（NA）核苷酸序列设计引物,进行RT-PCR扩增NA,将扩增获得的NA基因克隆与PMD-18载体,并测序,然后将该基因插入PET32中构建原核表达载体,最后将重组质粒构建的表达载体转化感受态细胞BL21,酶切鉴定后对其序列分析。结果:扩增的SIV NA基因片段大小约1410bp,与国内外分离毒株基因核苷酸和氨基酸序列的同源性在96.1%-99.6%和96.%-99.4%之间。将克隆的重组质粒与重组质粒构建的表达载体,进行PCR和酶切鉴定后,结果说明目的该基因的克隆原核表达载体的构建成功,这为猪流感病毒防制及其疫苗的进一步了研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 一 猪流感病毒结构
• 二 猪流感分子生物学特性
• （一） 病毒蛋白
• 1 血凝素（HA）
• 2 神经氨酸酶（NA）
• 3 核蛋白（NP）
• 4 基脂蛋白（M）
• 5 聚合酶蛋白（PA、PB1和PB2）
• 6 非结构蛋白（N S1和N S2）
• （二） 生物学特性
• 1 血凝特性
• 2 抗原性
• 3 增殖特性
• 三 猪流感流行病学研究进展
• 四 猪流感病毒诊断
• 4.1 病毒分离技术
• 4.2 琼脂扩散（AGP）技术
• 4.3 血凝（HA）和血凝抑制（H1）技术
• 4.4 酶联免疫吸附（ELISA）技术
• 4.5 荧光抗体（IF）技术
• 4.6 免疫组织化学技术
• 4.7 PCR技术
• 五 猪流感的危害及公共卫生意义
• 六 猪流感疫苗研究进展
• 6.1 灭活疫苗
• 6.2 亚单位疫苗
• 6.3 基因免疫
• 6.4 病毒活载体疫苗
• 七 目的和意义
• 实验1:广西猪群H1和H3亚型猪流感病毒抗体水平的监测
• 1 材料
• 1.1 猪流感H1诊断试剂:
• 1.2 检测样品
• 1.3 引物合成
• 2 方法
• 2.1 血清样品中抗体的检测
• 2.1.1 血凝抑制（HI）试验方法抗体检测
• 2.1.2 ELISA方法抗体检测
• 2.2 PCR的方法检测病料中的病原
• 2.2.1 病料中总RNA的抽提
• 2.3 SIV目的基因片段扩增
• 3 结果
• 3.1 规模猪场SIV抗体情况
• 3.2 散养户不同年龄阶段猪的SIV抗体水平
• 3.3 HI和ELISA检测H1亚型猪流感抗体符合率
• 3.4 禽流感病毒H5和H9亚型抗体检测
• 3.5 SIV的RT-PCR检测
• 3.6 不同市SIV感染情况
• 3.6.1 组织病料为检测样品
• 3.6.2 鼻腔棉拭子为检测样品
• 4 讨论
• 实验2:NA基因的克隆与原核表达载体的构建
• 1 材料
• 1.1 病料
• 1.2 试剂
• 1.3 载体和感受态细胞
• 1.4 主要仪器
• 1.5 主要培养基:
• 1.6 应用液的配制
• 2.方法
• 2.1 实验方案
• 2.2 引物设计与合成
• 2.3 病原体的RNA提取
• 2.4 NA基因RT-PCR的扩增
• 2.4.1 cDNA的制备
• 2.4.2 目的基因的扩增
• 2.5 PCR产物的克隆
• 2.5.1 PCR产物的回收与纯化
• 2.5.2 纯化PCR产物的克隆
• 2.5.3 感受态细胞的制备（DH5α,BL21（DE3））
• 2.5.4 连接产物转化感受态细胞
• 2.5.5 重组质粒的筛选
• 2.5.6 重组质粒的鉴定
• 2.6 目的基因序列测序鉴定与分析
• 2.6.1 目的基因序列的测定
• 2.6.2 目的基因测序结果分析
• 2.6.3 目的基因核苷酸、氨基酸的序列比较
• 2.7 重组表达载体的构建
• 2.7.1 pMD18-NA,pET-32a（+）质粒的制备
• 2.7.2 目的基因与载体的酶切
• 2.7.3 表达载体的构建及鉴定
• 3 结果
• 3.1 NA基因的RT-PCR扩增
• 3.2 阳性产物克隆的PCR鉴定
• 3.3 NA基因双酶切的鉴定
• 3.4 目的基因序列的测定及其分析
• 3.4.1 目的基因序列结果鉴定与分析
• 3.4.2 目的基因同源性比较及分析
• 3.5 重组表达载体的构建
• 4 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文件