甘露聚糖酶Man23的基因表达体系优化及其分子改造

论文摘要

来源于枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis B23的甘露聚糖酶Man23具有较高的酶活力和较好的热稳定性。为了进一步提高酶的活力、稳定性和表达水平,笔者在生物物理学、生物化学和分子生物学理论的指导下,运用蛋白质工程和基因工程的技术体外改造甘露聚糖酶Man23的基因及其表达体系。笔者采用常规方法从Bacillus Subtilis B23中克隆出甘露聚糖酶Man23的基因,连接到不同表达载体上,并转化至不同宿主细菌中,比较载体和宿主细菌对基因表达水平的影响,建立更为优良的基因man23表达体系。由优化的表达体系生产甘露聚糖酶Man23,对其进行分离纯化,获得电泳纯的酶Man23,以半合理设计的策略为指导,分析鉴定该酶的活性中心区域并加以改造,以期提高催化效率。通过对酶Man23的化学修饰初步研究了它的化学性质,掌握了酶分子中对其活性有显著影响的残基种类,同时,运用生物信息学软件来分析酶Man23的初级结构、二级结构和高级空间结构的特点,结合生物物理学的理论和丙氨酸扫描技术确定影响酶活力的位点,并对选择的可疑位点进行饱和突变,通过酶活力测定、突变酶反应动力学测定等对突变库进行筛选,保留高酶活、高效率的突变。此外,在对酶的稳定性进行研究的过程中,首先运用生物学软件分析了对稳定性有影响的各因素,如氢键、分子表面电荷分布、分子间键角等,根据分析获得的信息来优化各因素,建立突变体模型,以酶的耐受温度、长效试验等的测定结果为依据,筛选并保留高稳定性的突变。同时,对酶的微环境也进行了优化,分别添加多元醇、防腐剂、金属离子、糖类物质等,经正交试验确定保持液态酶稳定的复合稳定剂配比。研究结果表明,p43启动子能够显著提高甘露聚糖酶Man23基因的表达量,同时蛋白酶缺陷型芽孢杆菌用来作为基因表达的宿主菌也明显降低了目的酶的体外降解程度,重组的pHY-p43-man23表达质粒转入枯草芽孢杆菌WB600和Brevibacillus brevis细胞中构建成功的表达体系明显提高了目的蛋白酶的表达量,去除了多数的杂蛋白。此外,研究中还建立了半合理设计方法来分析甘露聚糖酶Man23的活性中心区域,通过传统的化学修饰法、丙氨酸扫描法和定点饱和突变法,结合计算机辅助分析软件,确定了甘露聚糖酶Man23的活性中心氨基酸及其位点。从化学修饰反应结果可得出,甘露聚糖酶Man23的最大吸收峰在336 nm,荧光光谱表现为色氨酸,且该残基位于酶蛋白分子内部的疏水区域,半胱氨酸残基为该酶的必需基团并形成了一个链内二硫键,羧基（Glu/Asp）和色氨酸残基也是该酶的活性必需基团。丙氨酸扫描和定点饱和突变结果表明D91和E191是参与酶Man23催化反应的关键位点,H129、H190、W196、F197、W198和W199是与底物结合过程相关的位点。从共价键分布与数量、分子表面电荷分布和立体键角合理性等影响分子稳定性的几个因素出发,在分析软件辅助下做定点突变,确定与目的酶的稳定性相关的位点,由饱和突变定向选择突变体,找到16个明显提高酶Man23稳定性的点突变体。整合上述突变位点,最终获得了在23个位点引入有效突变的目的酶表达基因,转化至B.brevis后产生的总蛋白含量提高了近3倍,突变酶M0710的甘露聚糖酶活力提高了10多倍,80℃下半衰期延长了3倍。对突变酶M0710的稳定剂也做了初步研究,单一因素试验考察了多元醇类化合物、防腐剂、金属离子和糖类化合物等对目的酶稳定性的影响,其中山梨酸钾、Na+、K+、Ca2+、蔗糖、乳糖对酶的稳定性有明显效果,通过正交试验最后确定效果最佳的液态酶M0710的稳定剂为山梨酸钟3%、氯化钠2%和蔗糖2%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 甘露聚糖酶简介
• 1.1 甘露聚糖酶来源和种类
• 1.2 甘露聚糖酶的结构特征
• 1.3 甘露聚糖酶的多样性
• 1.3.1 甘露聚糖酶的多样性表现
• 1.3.2 甘露聚糖酶多样性的分析
• 1.4 甘露聚糖酶的生理功能
• 1.5 甘露聚糖酶的研究概况
• 2 芽孢杆菌表达体系的简介
• 3 蛋白质体外改造及其技术
• 3.1 蛋白质的理性设计
• 3.2 蛋白质的非理性设计
• 3.2.1 易错PCR技术
• 3.2.2 DNA shuffling
• 3.2.3 DNA家族改组
• 3.2.4 StEP重组
• 3.2.5 部分基因片段改组
• 3.2.6 单链DNA家族改组
• 3.2.7 简并引物基因改组
• 3.2.8 基因组改组
• 3.2.9 随机引物体外重组法
• 3.2.10 过渡模板随机嵌合生长
• 3.2.11 酵母增强组合文库
• 3.2.12 渐增切割法产生杂和酶
• 3.2.13 不依赖序列同源性的蛋白质重组
• 3.2.14 其他分子进化的方法
• 3.2.15 突变库筛选策略
• 3.3 蛋白质的半合理设计
• 3.3.1 基于结构的有选择的随机突变
• 3.3.2 随机突变后的定点饱和突变
• 3.3.3 随机突变与定点饱和突变同步
• 3.3.4 计算机辅助的半合理设计
• 4 酶制剂的稳定性
• 第二章 甘露聚糖酶的基因表达体系优化及其酶学表征
• 1 试验材料
• 1.1 仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 菌种和质粒
• 1.4 溶液配置
• 2 方法
• 2.1 细菌总DNA的提取
• 2.2 质粒的制备
• 2.3 目的基因的克隆
• 2.4 PCR产物的电泳检测
• 2.5 PCR产物的纯化和回收
• 2.6 PCR产物的酶切
• 2.7 质粒pHY-p43的酶切、产物纯化及去磷酸化处理
• 2.8 目的基因与载体的连接
• 2.9 重组质粒pHY-p43-man23的构建和转化
• 2.9.1 重组质粒pHY-p43-man23的构建
• 2.9.2 重组质粒的转化
• 2.10 重组质粒pBPS-man23的构建和转化
• 2.10.1 Brevibacillus brevis细胞壁蛋白基因的启动子和信号肽的分析和克隆
• 2.10.2 质粒pKF34的构建
• 2.10.3 重组基因pBPS-man23的构建及其转化
• 2.11 酶的分离纯化
• 2.12 蛋白质含量测定
• 2.12.1 蛋白质标准曲线的制作
• 2.12.2 蛋白质浓度测定
• 2.13 酶活力的测定
• 2.13.1 甘露糖标准曲线的制作
• 2.13.2 甘露聚糖酶活力的测定
• 2.14 表达产物的电泳检测
• 3 结果
• 3.1 重组基因pHY-p43-man23的获得
• 3.1.1 甘露聚糖酶Man23全基因的克隆
• 3.1.2 质粒pHY-p43的制备和鉴定
• 3.1.3 基因man23和质粒pHY-p43的酶切及鉴定
• 3.1.4 酶切产物的连接及重组子的转化
• 3.2 重组表达质粒宿主菌的优化
• 3.3 man23基因启动子的确定
• 3.3.1 短短芽胞杆菌细胞壁蛋白基因的启动子和信号肽编码序列的获得
• 3.3.2 重组基因pBPS-man23在短短芽胞杆菌中的分泌表达
• 3.4 重组酶的纯化及酶学性质
• 3.4.1 重组酶的反应温度
• 3.4.2 重组酶的反应pH范围
• 3.4.3 重组酶的反应动力学
• 4 讨论
• 4.1 外源基因表达系统宿主菌的选择
• 4.2 芽孢杆菌体系中表达载体的选择
• 第三章 甘露聚糖酶Man23活性中心的鉴定及其催化效率的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 生物学分析软件和数据库
• 1.1.4 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 酶的制备
• 1.2.2 酶的化学修饰
• 1.2.3 二硫键的测定
• 1.2.4 蛋白质含量的测定
• 1.2.5 催化活力的测定
• 1.2.6 酶与底物结合的荧光光谱测定
• 1.2.7 吲哚基与羧基修饰作用动力学参数测定
• 1.2.8 催化反应的米氏常数测定
• 1.2.9 酶Man23分子结构的计算机辅助分析
• 1.2.10 基因man23在大肠杆菌中的转化
• 1.2.11 定点突变库的建立及筛选
• 2 结果
• 2.1 甘露聚糖酶Man23的活性相关基因
• 2.1.1 巯基修饰剂对酶活力的影响
• 2.1.2 羧基修饰剂对酶活力的影响
• 2.1.3 吲哚基修饰剂对酶活力的影响
• 2.1.4 其他修饰剂对酶活力的影响
• 2.2 基于结构信息学的计算机辅助分析
• 2.3 甘露聚糖酶Man23活性相关的特定位点
• 2.4 甘露聚糖酶Man23特定位点的饱和突变
• 3 讨论
• 3.1 半合理设计思路在鉴定酶的活性中心中的运用
• 3.2 甘露聚糖酶Man23活性中心的分子基础
• 第四章 甘露聚糖酶的稳定性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 计算机辅助设计方法
• 1.5 突变库的构建方法
• 1.6 蛋白质含量的测定
• 1.7 酶活力的测定
• 1.8 催化动力学的测定
• 1.9 酶的纯化和SDS-PAGE的方法
• 1.10 酶稳定性的评价
• 1.10.1 稳定剂对酶Man23耐热性的影响
• 1.10.2 稳定剂对酶Man23保存期的影响
• 1.10.3 复合稳定剂中组分及其比例的正交试验
• 2 结果
• 2.1 基于非共价键形成的定点突变
• 2.2 基于分子表面电荷分布的定点突变
• 2.3 基于立体键角合理化的定点突变
• 2.4 最终突变体M0710的获得
• 2.5 突变酶M0710的纯化及酶学性质的表征
• 2.6 单一稳定剂对甘露聚糖酶M0710稳定性的影响
• 2.6.1 多元醇类作为稳定剂对酶的影响
• 2.6.2 防腐剂作为稳定剂对酶的影响
• 2.6.3 金属离子作为稳定剂对酶的影响
• 2.6.4 糖类作为稳定剂对酶的影响
• 2.7 复合稳定剂对甘露聚糖酶Ma0710稳定性的影响
• 2.7.1 同类稳定剂协同作用对酶稳定性的影响
• 2.7.2 不同类型稳定剂协同作用对酶稳定性的影响
• 2.7.3 复合稳定剂最佳添加量的配比
• 2.7.4 复合稳定剂的长效试验
• 3 讨论
• 3.1 酶耐热性的分子基础
• 3.2 酶耐热性的微环境
• 第五章 研究结论和创新点
• 1 研究结论
• 2 创新点
• 参考文献
• 作者简历
• 在读期间发表文章
• 在读期间参与课题
• 博士在读期间获奖情况
• 致谢