郭晶晶全鹏曹任飞杨惠李瑶龚琳（通讯作者）
长沙医学院口腔医学院长沙410219
摘要：目的：探讨拔牙对雄性SD大鼠海马CA1区、皮层神经元细胞凋亡的影响。方法：建立实验性SD大鼠拔牙模型，通过拔除SD大鼠一侧上下颌共6颗臼齿后1W、3W、5W观察SD大鼠海马CA1区及皮层神经元凋亡情况。检测方法：对臼齿拔除SD雄性大鼠的海马、皮层进行HE染色和TUNEL染色，检测SD大鼠海马、皮层神经元细胞凋亡量。结果：与假手术组大鼠相比，拔牙组海马CA1区及皮层细胞凋亡量较假手术组较多，且胞核呈蓝黑色、核固缩、核膜下染色质聚集，差异有统计学意义。结论：拔牙可能会促进海马CA1区及皮层神经元细胞的凋亡，缺牙时间越长结果越明显。
关键词：牙齿拔除；细胞凋亡；tunel染色；记忆
拔牙是口腔医学中最常见的小手术。口腔颌面外科学、口腔正畸学、口腔牙周病学、口腔牙体牙髓学等都会涉及拔牙，而拔牙对人类有没有影响有待探究[1-3]。已有研究证明牙齿拔除对大脑学习记忆功能会产生一定的影响。海马结构[6]是研究较多的与学习记忆有关的脑区，大脑的学习记忆功能受损，会表现为海马区大量的神经元细胞凋亡。因此，本文以成年SD大鼠为实验对象，通过对拔牙SD大鼠海马、皮层进行HE染色和TUNLE染色等实验，检测SD大鼠海马、皮层神经元凋亡的改变，从而确定牙齿拔除对SD大鼠大脑学习记忆功能的影响[4]。
1材料和方法
1.1材料
选50只健康清洁级雄性SD大鼠，购自湖南省湘雅实验动物中心，体质量200～220g，随机进行分成等量的5组，模型组是根据口腔专业拔牙技术方法，建立大鼠拔牙组模型。
1.2建模方法
腹腔注射10％水合氯醛（4ml／kg）麻醉大鼠并将其仰卧固定在拔牙板上，拔除SD大鼠右侧上下颌臼齿6颗，分别术后休养1w、3w、5w后制作标本。
1.3实验分组和观察
共分为实验组、麻醉对照和空白对照三组，三组接受不同处理方法，具体如下：
（1）实验拔牙组：拔牙数目6颗，分别术后休养1w、3w、5w。
（2）麻醉对照组：腹腔注射10％水合氯醛（4ml／kg）麻醉大鼠并将其仰卧固定在拔牙板上，不拔除牙齿，其余同等对待。
（3）空白对照组：给予大鼠腹腔注射0.9%生理盐水（4ml／kg），并将其仰卧固定在把压板上，不拔除牙齿，其余同等对待。
1.4标本制备
各组动物同一时间拔牙后休养1w、3w、5w后进行10％水合氯醛麻醉，开胸，40g／L多聚甲醛经心灌流固定10min后，断头取脑，再放于40g／L多聚中固定12～24h后，放于30%高浓度蔗糖中过夜，直至脑沉底。待脑沉降后，取脑组织标本海马处用恒冷箱切片机连续冠状切片，厚10μm，贴附于防脱载玻片上待用，并进行HE染色。
1.5统计学处理
计量资料以（均值±标准差）表示，统计分析采用SPSS17.0统计软件进行数据统计处理。采用CMIAS真彩色医学自动分析系统进行细胞计数。选取具有代表性的4个视野，切片在400倍光镜下观察，以平均值代表各区计数结果，P<0.05为有统计学意义。
2结果
2.1HE染色观察核固缩细胞数量及细胞核形态
空白组SD大鼠皮质偶见细胞变性及细胞核褐色深染。1w、3w、5w组组皮质和海马CA1可见大量细胞变性及细胞核褐色深染，细胞核固缩，核变性，且随时间增长变性细胞数量增加。
2.2TUNEL细胞凋亡检测
分别取空白组和拔牙组术后休养1w、3w、5w的脑片进行检测，室温下固定30min，浸入PBS漂洗2次（每次15min），再把样本浸入封闭液10min，最后标记和显色，封片及拍照。在标记反应的过程中不添加TdT酶反应液做阴性对照，其余步骤均相同。TUNEL染色阳性物质定位于细胞核，胞核呈蓝黑色，核固缩，核膜下染色质聚集。选择随机海马CA1区椎体细胞层，进行阳性细胞计数，每张切片取4个视野，计算凋亡指数（AI）。结果见图1。
3讨论
在研究中发现，拔牙6颗饲养分别1-5周。细胞凋亡率明显高于对照组的凋亡率，细胞凋亡率与饲养时间呈正关。海马CA1区是研究较多的与学习记忆有关的脑区，它不仅和陈述性记忆有关，还涉及认知功能和位置导航，是一重要的信息处理部位。大量研究己证明其与学习记忆特别是空间认知功能有关，所以海马区神经元细胞的凋亡会影响学习记忆能力。因此，结果证明拔牙数量越多，缺牙的周数越多，对皮质和海马CA1细胞凋亡量的影响就越大[6-7]。
参考文献：
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[3]李梅.免疫组化热修复应用于tunel染色[J]，临床与实验病理学杂志，2013，29（7）：19-21.
[4]刘泽林.氨茶碱对淋巴瘤细胞系增殖与凋亡的影响及机制探讨[J]，中国实验血液学杂志，2003，11（1）：45-49.
[5]冯力民，吴真，佟也芒，等.用水迷宫建立大鼠空间辨别性学习记忆模型［N］.北华大学学报（自然科学版），2007，8（1）：46-49.
[6]贾贺，张博爱，慢性脑缺血大鼠海马CA1区椎体细胞树突形态及树突棘密度的变化《中国病理生理学杂志》2012，28（1）：177-180.
[7]韩维媚，大鼠空间学习记忆和海马长时程增强的相关性研究[J].中华行为医学与脑科学杂志，2012，21（7）：110-113.
基金项目：湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（湘教通【2013】191-429）