鳜鱼胰蛋白酶分离纯化、性质鉴定及分子克隆

论文摘要

胰蛋白酶（Trypsin,EC 3.4.21.4）是丝氨酸蛋白酶家族中一种专门水解蛋白质赖氨酸（Lys）残基和精氨酸（Arg）残基的肽链内切酶,在鱼体内起着重要的生理和消化功能。在低温下仍然具有高活性的鱼体胰蛋白酶对食品加工行业具有重要意义。但是,目前国内外关于淡水鱼胰蛋白酶的报道很少。本课题首次以淡水鳜鱼为研究对象,对其幽门垂胰蛋白酶进行了分离纯化,研究其酶学性质,并对胰蛋白酶进行了分子克隆,为今后研究淡水鱼类胰蛋白酶的生理功能、消化功能以及这类酶在食品加工中的应用提供了理论基础。本课题分离纯化胰蛋白酶的方法包括硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel阴离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析、Q-Sepharose阴离子交换层析和SP-Sepharose阳离子交换层析等。本研究得到了两种类型的胰蛋白酶即阴离子型胰蛋白酶Trypsin A和阳离子型胰蛋白酶Trypsin B。SDS-PAGE、Native-PAGE和Casein-zymography结果表明Trypsin A和Trypsin B都得到了高度纯化并且都是单体结构。SDS-PAGE显示Trypsin A和Trypsin B的分子量分别为21 kDa和21.5 kDa。用Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物,二者的最适温度分别为35和40°C,最适pH值均为pH 8.5。热稳定性与pH值稳定性实验表明,Trypsin A和Trypsin B在45°C以下加热30 min可保持其活性, pH值的耐受范围为4.5至11.0。抑制剂实验表明丝氨酸类蛋白酶抑制剂都可以对这两种胰蛋白酶强烈抑制,并且两种酶的抑制效果相似。底物特异性实验表明Trypsin A和Trypsin B对荧光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA的分解能力最强。金属离子实验表明,这两种胰蛋白酶可被一定浓度范围的Ca2+和Mg2+离子激活,而被Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Al3+、Ba2+和Co2+离子在一定程度上抑制。动力学实验表明,以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物,Trypsin A与Trypsin B的Km值分别为2.18和1.88μM,所对应的Kcats值分别为81.6和111.3 s-1。免疫印迹实验表明,鳜鱼胰蛋白酶可以和抗鲤鱼胰蛋白酶抗体呈阳性反应。氨基酸测序结果表明,Trypsin B的N-末端氨基酸序列为IVGGYECEAH,该序列和来自其它鱼氨基酸序列有高度的同源性。在分子克隆工作中,以胰蛋白酶保守位点及已测序的胰蛋白酶Trypsin B的N-末端氨基酸序列为依据设计引物,利用3’ RACE、5’ RACE及RT-PCR的方法得到了两条编码鳜鱼胰蛋白酶的基因序列,并分别命名为TRS-A与TRS-B,基因序列的GenBank登录号分别为EU688996和EU688997,相应的氨基酸序列GenBank登录号为ACD70339与ACD70340。TRS-A的cDNA全长为869 bp,该序列包括一个23 bp的5’非编码区,729 bp的开放阅读框和117 bp的3’非编码区,开放阅读框编码242个氨基酸,其中222个氨基酸组成成熟蛋白区域,有15个氨基酸的信号肽和5个氨基酸组成的激活肽,成熟蛋白分子量为24111.16 Da。TRS-B的cDNA全长为885 bp,该序列包括23 bp的5’非编码区,729 bp的开放阅读框和133 bp的3’非编码区。和TRS-A一样,TRS-B的开放阅读框编码242个氨基酸,其中222个氨基酸组成成熟蛋白区域,有15个氨基酸的信号肽和5个氨基酸组成的激活肽,成熟蛋白分子量为24243.16 Da。三个活性位点中心位点His-60、Asp-104和Ser-196都保守性地存在于鳜鱼胰蛋白酶蛋白质一级结构中。TRS-A与TRS-B编码的氨基酸序列同源性为84.71%。鳜鱼胰蛋白酶与其它鱼类胰蛋白酶的同源性在80%以上。利用生物信息学软件对TRS-A及TRS-B编码的氨基酸序列进行了氨基酸组成、酶切位点、二级结构、三级结构等性质进行了分析预测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 鳜鱼简介
• 1.2 胰蛋白酶研究现状
• 1.2.1 胰蛋白酶原和胰蛋白酶
• 1.2.2 胰蛋白酶分离纯化
• 1.2.3 胰蛋白酶（原）基因的研究
• 1.3 胰蛋白酶应用的研究
• 1.4 本课题研究的内容与意义
• 参考文献
• 第二章 鳜鱼蛋白酶的分离纯化及性质鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 动物
• 2.1.1.2 试剂
• 2.1.1.3 实验所用溶液及其制备
• 2.1.1.4 实验所用仪器
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 胰蛋白酶活性的测定
• 2.1.2.2 胰蛋白酶浓度的测定
• 2.1.2.3 SDS-PAGE，Native-PAGE 及Casein-zymography
• 2.1.2.4 提取纯化方案
• 2.1.2.5 性质分析
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 胰蛋白酶的分离纯化
• 2.2.1.1 硫酸分级范围确定
• 2.2.1.2 胰蛋白酶的柱层析分离
• 2.2.2 胰蛋白酶的性质研究
• 2.2.2.1 电泳和酶谱
• 2.2.2.2 蛋白酶抑制剂及底物特异性作用
• 2.2.2.4 金属离子对胰蛋白酶活性的影响
• 2.2.2.5 鳜鱼胰蛋白酶的温度范围和温度稳定性
• 2.2.2.6 鳜鱼胰蛋白酶的pH 范围和pH 稳定性
• 2.2.2.7 鳜鱼胰蛋白酶的动力学参数
• 2.2.2.8 鳜鱼胰蛋白酶的免疫印迹反应
• 2.2.2.9 鳜鱼胰蛋白酶的氨基酸序列测定
• 参考文献
• 第三章 鳜鱼胰蛋白酶原的分子克隆及序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 动物
• 3.1.1.2 菌种及质粒
• 3.1.1.3 试剂
• 3.1.1.4 实验所用溶液及其配制
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 总RNA 提取
• 3.1.2.2 引物设计
• 3.1.2.3 鳜鱼胰蛋白酶原的分子克隆
• 3.1.2.4 PCR 扩增产物的电泳检测及目的基因片段的回收
• 3.1.2.5 基因片段与pBS-T 载体的连接
• 2 法制备感受态细胞'>3.1.2.6 CaCl₂法制备感受态细胞
• 3.1.2.7 连接产物的转化及重组质粒的鉴定
• 3.1.2.8 核苷酸序列的测定和分析
• 3.1.2.9 胰蛋白酶基因推导蛋白质序列分析及结构预测
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 总RNA 提取的结果
• 3.2.2 胰蛋白酶原基因的克隆
• 3.2.2.1 胰蛋白酶原中间片段扩增
• 3.2.2.2 胰蛋白酶原3'末端的扩增
• 3.2.2.3 胰蛋白酶原5'末端的扩增
• 3.2.3 胰蛋白酶基因序列分析
• 3.2.3.1 核苷酸序列分析
• 3.2.3.2 氨基酸序组成分析
• 3.2.3.3 蛋白质信号肽与激活肽分析
• 3.2.3.4 蛋白质酶切位点分析
• 3.2.3.5 二级结构结构预测
• 3.2.3.6 三级结构预测
• 3.2.3.7 系统进化树分析
• 3.2.3.8 氨基酸序列对比分析
• 参考文献
• 第四章 结论与展望
• 致谢
• 在学期间发表的学术论文