人脐带间充质干细胞生物学特性及体内移植促进皮肤创面修复的实验研究

论文摘要

目的本研究旨在建立一种分离、培养扩增脐带源间充质干细胞（human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）的方法,通过对其基本生物学特性、体外诱导分化能力、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP）基因质粒对其标记示踪的可能性及体内移植促进皮肤创面修复的可行性等的研究,以期为组织工程种子细胞提供新的细胞来源,为烧伤、肿瘤等导致的皮肤缺损患者的临床治疗提供新思路。方法1、首先建立hUC-MSCs分离和培养扩增的方法并通过细胞形态学、细胞增殖的研究、细胞免疫表型分析及体外诱导分化能力的检测对其基本生物学特性进行研究并与生物学特性研究较多的脐血间充质干细胞（human umbilicalcord blood hUCB-MSCs）进行比较（骨髓间充质干细胞Bone marrow mesenchymal stem cells BM-MSCs的生物学特性研究最多,但本实验由于骨髓标本来源受限）。2、将已转化的GFP-N2大肠杆菌109菌种,进行质粒提取,脂质体（lipofectamine 2000）介导转染hUC-MSCs,分别于转染24h,96h后计算荧光的转染效率,以未标记的同期细胞作为对照。3、将已标记绿色荧光蛋白基因质粒的hUC-MSCs移植至表皮缺损的裸鼠表皮缺损处,采用组织切片、免疫荧光等方法检测裸鼠表皮愈合及hUC-MSCs在皮肤缺损处的分布。结果1、hUC-MSCs接种后24-48h贴壁,成纤维细胞样克隆形成（Unit-fibroblast like colony-forming,CFU-F）时间为5-7d,首次传代时间为12-16d,对数生长期细胞倍增时间为29h,均较hUCB-MSCs短。免疫表型分析显示hUC-MSCs和hUCB-MSCs均表达粘附分子和基质细胞标记CD13、CD29、CD105、CD166,不表达造血细胞标记CD14、CD34、CD45,不表达内皮细胞标记CD31,两者表型基本一致,无明显区别。此外,实验还证实hUC-MSCs具有向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化能力。2、绿色荧光蛋白基因质粒转染的hUC-MSCs 24h后绿色荧光表达率为37%,而且短期内随着培养时间延长,表达率有上升趋势。3、实验组裸鼠大体观察表皮愈合较对照组好,组织切片见实验组皮肤结构层次较清晰而对照组大多数为疤痕愈合,结构层次不清楚,免疫荧光观察见hUC-MSCs在表皮缺损愈合的新生血管中有存活,对照组为阴性。结论1、成功建立了从人足月脐带中分离培养扩增hUC-MSCs的方法,操作简单、易行,分离培养的hUC-MSCs具有MSCs的基本生物学特性和免疫表型,且比hUCB-MSCs含量更丰富,具有更强的增殖能力,可以作为组织工程新的细胞来源。2、脂质体介导的绿色荧光蛋白基因质粒转染hUC-MSCs标记示踪技术是一种理想的较稳定示踪标记技术,可以应用为组织工程种子细胞示踪的实验研究。3、hUC-MSCs机体内移植能促进皮肤缺损的愈合,可为皮肤缺损患者的临床治疗提供理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 第二章 脐带 MSC 体外分离培养、传代及生物学性状研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 主要仪器与材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 形态学观察
• 2.2.2 细胞增殖能力测定（MTT 法）
• 2.2.3 流式细胞术检测细胞表面标志
• 2.2.4 脐带MSCs 向成骨细胞诱导分化能力的检测
• 2.2.5 脐带 MSC 向脂肪细胞定向诱导分化能力的检测
• 2.3 讨论
• 第三章 绿色荧光蛋白基因质粒转染脐带 MSC
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要仪器与材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 第四章脐带 MSC 体内移植促进皮肤创面愈合的初步研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 大体观察及创面愈合指数
• 4.2.2 组织学观察
• 4.2.3 带标记 MSCs 在创面的存留
• 4.2.4 免疫组织化学检测Ⅷ因子
• 4.3 讨论
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 中英文缩略语对照
• 攻读学位期间的研究成果