脊髓星形胶质细胞TLR3在神经病理性痛中的作用

论文摘要

第一部分脊神经结扎大鼠脊髓星形胶质细胞ToⅡ样受体（TLR3）的表达目的评价脊神经结扎疼痛模型大鼠脊髓星形胶质细胞TLR3的表达以及在慢性神经病理性痛中的作用。方法雄性SD大鼠66只，体重180～250g，随机分为两组：SHAM组（假手术组，n=30），分离右侧L5脊神经但不结扎。SNL组（n=36），结扎右侧L5脊神经。每组大鼠均于术前1d、术后1、3、5、7、10、14、21、28d行行为学实验；SNL组于结扎后7d随机取6只大鼠利用双重免疫荧光标记法观察脊髓背角GFAP和TLR3的表达；每组于术后3、7、14、21、28d各随机取6只大鼠断头处死，取L4-5脊髓节段采用RT-PCR法测定TLR3 mRNA的表达。结果与SHAM组比较，SNL组PWPT和PWL降低（P＜0．05）；SNL组大鼠术后7d脊髓背角（术侧）GFAP阳性表达的细胞，TLR3也呈阳性表达。与基础值比较，SNL组脊髓背角TLR3 mRNA表达上调（P＜0．05）。结论脊髓背角星形胶质细胞TLR3表达上调可能参与了脊神经结扎大鼠慢性神经病理性痛的发生与发展。第二部分脊髓星形胶质细胞TLR3在大鼠神经病理性痛中的作用实验一鞘内注射聚肌苷-多聚胞嘧啶核苷酸（poly（I:C））诱发神经病理性痛的实验研究目的评价脊髓星形胶质细胞TLR3在大鼠神经病理性痛中的作用。方法雄性SD大鼠，体重180～250g，126只鞘内置管成功的大鼠，随机分为3组，正常对照组（C组，n=42）；生理盐水组（NS组，n=42）鞘内注射NS 0．5 ml/kg，1次/d，连续7 d；神经病理性痛组（NP组，n=42）腹腔注射米诺环素40 mg/kg+鞘内注射poly（I:C）0．5 mg/kg，1次/d，连续7 d。各组大鼠于鞘内给药前1 d和鞘内给药后1、3、5、7、10、14、21、28 d测定机械痛阈和热痛阈；各组于鞘内给药后7 d各取6只大鼠，取L4-5脊髓节段，采用免疫组化法测定脊髓背角胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达；各组于鞘内给药前1 d和后1、7、14、21、28 d各取处死6只大鼠，取L4-5脊髓节段，采用RT-PCR法测定TLR3 mRNA的表达变化趋势，以及术后7 d IL-6、TNF-a、IFN-β和IP-10 mRNA的表达，并使用ELISA法测定IL-6和IP-10蛋白变化。结果与C组和NS组比较，NP组PWPT降低并持续至术后28天（P＜0．05）；NP组脊髓背角GFAP免疫反应阳性产物表达相对面积分别增加93．1％（P＜0．01）和90．9％（P＜0．01）；与基础值比较，NP组脊髓背角TLR3 mRNA表达上调（P＜0．05）。与NS组比较，NP组鞘内注射poly（I:C）后7 d天脊髓IL-6、TNF-a、IFN-β和IP-10 mRNA表达均上调（P＜0．05），脊髓IL-6（9．5ng/g）和IP-10（12．3ng/g）蛋白表达显著上调（P＜0．05）。结论脊髓背角星形胶质细胞TLR3可能参与了大鼠神经病理性痛的形成与维持。实验二鞘内注射TLR3反义寡聚核苷酸对脊神经结扎大鼠的镇痛作用目的探讨脊髓星形胶质细胞TLR3在神经病理性疼痛中的作用。方法雄性SD大鼠，体重180～250 g。实验Ⅰ108只鞘内置管大鼠随机分为：生理盐水（NS）20μl+脊神经结扎（SNL）（A组，n=36），错义寡聚核苷酸（MM-ODN）20μg/d+SNL（B组，n=36），反义寡聚核苷酸（AS-ODN）20μg/d+SNL（C组，n=36）。实验Ⅱ108只SNL后7d大鼠随机分为：SNL+NS 20μl（D组，n=36），SNL+MM-ODN 20μg/d（E组，n=36），SNL+AS-ODN 20μg/d（F组，n=36）。实验Ⅰ和实验Ⅱ分别于SNL前1d和后7d开始鞘注，每天一次，共7d；于术后-1、1、3、5、7、10、14d和-1、7、10、12、14 d行行为学实验。实验Ⅰ和实验Ⅱ分别于术后7d和14d每组各随机取6只大鼠利用免疫组织化学法观察脊髓背角GFAP的表达，并于术后-1、3、7、14d和术后-1、7、10、14d每组各随机取6只大鼠断头处死，取L4-5脊髓节段采用RT-PCR法测定TLR3和IL-6mRNA的表达，以及于术后7 d和术后14 d使用ELISA法测定IL-6和IP-10蛋白变化。结果实验Ⅰ与A组比较，C组PWPT升高并持续至术后14d（P＜0．05），C组各时点PWL无明显变化（P＞0．05）；与A组和B组比较，C组脊髓背角GFAP免疫反应阳性产物表达相对面积分别下降46．4％（P＜0．01）和45．7％（P＜0．01）；与A组和B组比较，C组鞘内注射AS-ODN抑制了TLR3和IL-6 mRNA以及IL-6和IP-10蛋白的表达（P＜0．05）。实验ⅡD组、E组和F组在PWPT、PWL、GFAP表达、TLR3和IL-6 mRNA以及IL-6和IP-10蛋白表达方面的差异无统计学意义（P＞0．05）。结论脊髓背角星形胶质细胞TLR3可能参与了神经病理性疼痛的发生与发展。第三部分脊髓背角c-Jun氨基末端激酶（JNK）活化在TLR3介导的神经病理性痛中的作用目的观察大鼠鞘内注射poly（I:C）及TLR3反义寡聚核苷酸后脊髓背角c-Jun氨基末端激酶（JNK）活化水平的变化，探讨JNK在TLR3介导的神经病理性痛中作用。方法雄性SD大鼠24只，体重180～250g，随机分为4组：A组（n=6），鞘内注射poly（I:C）0．5mg/kg；B组（n=6），鞘内注射SP600125 50nmol+poly（I:C）0．5mg/kg，A和B组每天鞘内注射一次，共7 d；C组（n=6），鞘内注射MM-ODN20μg/d+脊神经结扎（SNL）；D组（n=6），鞘内注射AS-ODN 20μg/d+SNL，C和D组于SNL前一天开始鞘内注射；每天一次，共7 d。A、B组和C、D组分别于鞘内注射和SNL后-1、1、3、5、7d行行为学实验，并分别于鞘内注射和SNL后7d每组取6只大鼠利用免疫荧光组织化学法观察脊髓背角pJNK的表达。结果与A组比较，B组PWPT下降被SP600125阻止（P＜0．05），PWL无明显变化（P＞0．05）；与C组比较，D组AS-ODN阻止了PWPT下降（P＜0．05），PWL无明显变化（P＞0．05）。与A组比较，B组大鼠脊髓背角pJNK表达明显减少，阳性细胞数减至20±3（P＜0．05）；与C组比较，D组大鼠脊髓背角pJNK表达亦明显减少，阳性细胞数为27±5（P＜0．05）。结论脊髓背角JNK活化水平增加，JNK通路激活，可能参与了TLR3介导的神经病理性痛的形成。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 脊神经结扎大鼠脊髓星形胶质细胞TLR3的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 脊髓星形胶质细胞TLR3在大鼠神经病理性痛中的作用
• 实验一 鞘内注射poly（I:C）诱发神经病理性痛的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 实验二 鞘内注射TLR3反义寡聚核苷酸对脊神经结扎大鼠的镇痛作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 脊髓背角JNK活化在TLR3介导的神经病理性痛中的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述 TLR3的研究进展
• 参考文献
• 附录 在校期间发表的论文
• 致谢