聚肌胞体内外抗病毒活性、毒性研究及其微囊的制备与评价

论文摘要

聚肌胞（polyinosinic:polycytidylic acid copolymer, Poly I:C）是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物,是一种高效的干扰素（IFN）诱生剂,具有广谱抗病毒、刺激吞噬、调整机体免疫、抗肿瘤、抗某些细菌和原虫感染等功能。目前Poly I:C的应用报道多集中在人类医学上用于治疗肝炎、疱疹病毒感染及一些肿瘤性疾病等方面,显示了其确实的临床疗效。虽然Poly I:C在兽医临床中也有治疗猪瘟、鸭瘟等疾病的报道,但与此相关的资料却十分鲜见,更缺乏深入的研究。本文对Poly I:C体内外抗病毒活性及毒性作用进行了研究,并为解决Poly I:C价格昂贵,在体内容易被血清酶降解及注射使用易造成应激反应等限制其在畜牧养殖业中使用的问题,制备了具有缓慢释放作用的Poly I:C微囊并对其进行了体内外效果评价。Poly I:C对离体培养鸡胚CEF细胞的抗病毒活性研究为探讨Poly I:C的抗病毒效果及其机理,选择鸡新城疫病毒（Lasota株）和水疱口炎病毒（VSV）对离体培养的鸡胚成纤维（CEF）细胞进行病毒感染,分别研究Poly I:C对离体培养鸡胚CEF细胞的病毒抑制和干扰素测定试验。试验结果表明,Poly I:C能显著抑制NDV在CEF细胞上生长,但Poly I:C对NDV的抑制作用并非随着其剂量的增加和作用时间的延长而增强,60μg/mL的Poly I:C在CEF细胞上作用12 h后,产生的抗病毒活性最强；PolyI：C抑制水疱口炎病毒在CEF细胞上生长的结果表明,Poly I:C具有免疫刺激活性,Poly I:C能诱导IFN-αmRNA和IFN-βmRNA转录水平升高,说明Poly I:C的抗病毒作用和其诱导产生的干扰素有关；而且IFN-βmRNA转录水平是IFN-αmRNA表达量的数倍,说明IFN-β在抗病毒活性中起主要作用；然而,Poly I:C也同时能抑制CEF细胞的生长,且与Poly I:C剂量和作用时间成正比,说明Poly I:C具有一定的毒副作用,在临床使用时,应注意使用剂量和使用频度。Poly I:C对感染NDV的鸡胚和肉鸡的抗病毒活性研究为探讨Poly I:C在体内的抗病毒效果,本研究通过Poly I:C对感染NDV的SPF鸡胚和肉鸡进行了体内病毒抑制试验。SPF鸡胚体内病毒抑制试验结果显示,5 mg·mL-1的Poly I:C溶液（0.1 mL/枚）能明显抑制NDV在SPF鸡胚中的繁殖,减轻NDV对鸡胚生长的抑制作用,降低病毒血凝价和鸡胚死亡数；Poly I:C对肉鸡抵抗NDV感染的试验结果显示,注射0.02 mg/kg·bw,0.01 mg/kg·bw和0.005 mg/kg·bw的Poly I:C后,肉鸡死亡率分别为40%、20%和26.7%,均极显著低于攻毒对照组的63.3%（P<0.01）。Poly I:C诱导鸡胚CEF细胞凋亡的研究为研究Poly I:C对CEF细胞的毒性及其机理,将Poly I:C与CEF细胞共孵育后,对CEF细胞活性、形态变化、磷脂酰丝氨酸外翻、DNA片段形成、caspase-3, caspase-8, caspase-9活性变化及RIPK1 mRNA和TNFRSF8 mRNA转录水平等进行检测。试验结果显示,随着PolyI:C药物浓度和作用时间的延长,CEF细胞活性降低,成剂量和时间正相关,表明PolyI:C对CEF细胞具有一定的毒性作用；磷脂酰丝氨酸外翻和DNA片段形成显示,Poly I:C可诱导CEF细胞的凋亡；随着作用时间的延长,caspase-3活性升高,说明Poly I:C引起的凋亡和caspapse激活途径相关；caspase-8活性升高,而caspase-9活性没有显著变化的结果说明Poly I:C诱导凋亡和死亡受体途径相关；TNFRSF8mRNA转录水平增加说明凋亡和TNFRSF8上调有关。Poly I:C微囊的制备与体外评价以乙基纤维（EC）为囊材,采用液中干燥法制备Poly I:C缓释微囊。通过正交实验对成囊试验条件进行优化,试验结果表明,700 rpm转速、0.4g硬脂酸镁、2%司盘-80、囊材占丙酮质量2.5%、丙酮和石蜡体积比30：30为最佳制备条件。对最佳条件制备的微囊进行体外试验评价,微囊大小均一,平均粒径93.56μm,载药率为0.64%,包封率为74%,体外释放度随着聚乙二醇-2000（PEG-2000）的含量增加而增大。Poly I:C微囊对NDV感染肉鸡IFN-α及免疫活性的诱导效应为了评价口服型PolyI：C微囊抗病毒的效果及其与注射型Poly I:C的疗效差异,本文通过给新城疫病毒（NDV）感染肉鸡口服Poly I:C微囊,测定了人工感染NDV肉鸡体内α-干扰素（IFN-α）和反映机体免疫活性状态的特异性和非特异性免疫功能指标。结果显示,口服型PolyI：C微囊所呈现的治疗效果与其注射型可产生相同的诱导IFN-α的能力,说明Poly I:C微囊在内服吸收过程中,受到消化道中核苷酸酶降解的程度并不显著；一定剂量范围内,Poly I:C诱导产生IFN-α的能力与剂量成正比,但超过一定剂量范围（0.2 mg/kg·bw）则可能产生抑制；Poly I:C具有提高机体细胞免疫功能的能力,对体液免疫功能没有明显的调节作用。Poly I:C微囊抗病毒作用和免疫调节作用可能是一方面通过诱导机体产生IFN-α而降低NDV对机体免疫系统的损害,另一方面通过参与调节机体的细胞免疫。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 聚肌胞概述
• 1 Poly I:C的合成
• 2 Poly I:C的理化性质
• 3 Poly I:C的药理学
• 4 Poly I:C的毒理学
• 5 Poly I:C药动学及脏器分布
• 第二章 微胶囊概述
• 1 微胶囊的组成
• 2 微胶囊发展史
• 3 载药微胶囊的概述
• 4 微胶囊的囊材
• 5 微胶囊的制备方法
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第一章 Poly I:C对离体培养鸡胚成纤维细胞的抗病毒活性研究
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 Poly I:C与病毒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 试验方法
• 1.4 统计分析
• 2 实验结果
• 2.1 Poly I:C对CEF细胞活性的影响
• 2.2 Poly I:C对VSV抑制作用
• 50的检测结果'>2.3 细胞病变和NDV TCID₅₀的检测结果
• 2.4 Poly I:C对NDV的抑制作用
• 2.5 Poly I:C诱导CEF细胞产生IFN-β
• 2.6 实时荧光定量PCR测定CEF中Ⅰ型IFN mRNA表达
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 Poly I:C对感染NDV鸡胚和肉鸡的抗病毒活性研究
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 Poly I:C对SPF鸡胚抵抗NDV（Lasota株）感染试验
• 1.3 Poly I:C对肉鸡抵抗NDV（F48E8标准株）感染试验
• 1.4 统计方法
• 2 实验结果
• 2.1 Poly I:C对SPF鸡胚抵抗NDV（Lasota株）感染试验
• 2.2 Poly I:C对肉鸡抵抗NDV（F48E8标准株）感染试验
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 Poly I:C诱导鸡胚成纤维细胞凋亡的研究
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 数据分析
• 2 试验结果
• 2.1 Poly I:C对成纤维细胞活性的影响
• 2.2 Poly I:C对CEF细胞形态结构的影响
• 2.3 Poly I:C诱导CEF细胞凋亡
• 2.4 DNA片断化和DNA Ladder的形成
• 2.5 Poly I:C对caspase-3,caspase-8,caspase-9活性的影响
• 2.6 Poly I:C对TNFRSF8 mRNA和RIPK1 mRNA转录水平的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 Poly I:C微囊的制备与体外评价
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 统计分析
• 2 结果
• 2.1 Poly I:C标准曲线
• 2.2 转速、硬脂酸镁、span-80对Poly I:C微囊形成的影响
• 2.3 微囊制备最佳条件优化
• 2.4 微囊形态、粒径大小及分布
• 2.5 载药率和包封率测定
• 2.6 体外释放度测定
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 Poly I:C微囊对NDV感染肉鸡α-干扰素及免疫活性的诱导效应
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 统计分析
• 2 结果
• 2.1 症状和疗效观察
• 2.2 口服Poly I:C微囊诱导机体产生IFN-α的测定
• 2.3 口服Poly I:C微囊对肉鸡体内NDV抗体的影响
• 2.4 口服Poly I:C微囊对肉鸡外周血T淋巴细胞含量的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 论文创新点
• 致谢
• 论文发表情况