低氧情况下miR-188-5p以cyclinD1为靶基因抑制CNE细胞增殖

论文摘要

低氧环境是肿瘤生成和快速生长过程中的重要特征。肿瘤细胞会发生一些重大生理过程的变化以适应低氧环境,这些变化包括血管生成、减缓增殖及改变代谢。本实验室已经在前期实验中证明了miRNA在调节低氧诱导的肿瘤血管生成中起重要作用,但还不清楚miRNA是否在低氧诱导的肿瘤细胞增殖减缓和代谢变化中起作用。本文研究miRNA对低氧情况下肿瘤细胞增殖的影响及其机理。MiRNA是由2024个核苷酸组成的非编码小RNA,可以通过与目标基因mRNA 3’UTR上的靶点结合,介导mRNA的降解或阻碍mRNA的翻译,从而导致目标蛋白表达水平的下降。近十年来,研究者发现miRNA在胚胎发育及细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程中发挥着极其重要的功能。关于miRNA在肿瘤生成过程中尤其是低氧情况下的功能是目前的研究热点。本研究以鼻咽癌细胞为模型,用DFOM模拟低氧环境,通过分析miRNA芯片和cDNA芯片结果,发现在低氧后表达上调的的miRNA和表达下调的cyclin D1之间可能存在反向相关关系。通过MTT实验发现低氧后细胞增殖减缓及过表达的miR-188-5p能抑制细胞增殖。通过RT-PCR和western blotting发现过表达的miR-188-5p能抑制cyclin D1 mRNA水平和蛋白水平的表达。用靶点预测软件发现在cyclin D1 mRNA 3’UTR上有3个潜在的miR-188-5p结合位点。通过荧光素酶报告载体实验验证miR-188-5p能与其中一个靶点结合,抑制荧光素酶基因的表达。本研究证明,低氧后上调表达的miRNA miR-188-5p能通过与cyclin D1基因mRNA 3’UTR上的靶点结合,在mRNA水平和蛋白水平抑制cyclin D1的表达,阻碍细胞周期的进行,从而抑制肿瘤细胞的增殖。这可能是肿瘤细胞适应低氧环境的机制之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 miRNA 的发现
• 1.2 miRNA 的转录与成熟
• 1.2.1 miRNA 的转录
• 1.2.2 miRNA 的成熟
• 1.3 miRNA 对基因转录后水平的调控
• 1.4 miRNA 生成的调节
• 1.5 microRNA 编辑（microRNA editing）
• 1.6 miRNA 靶点的预测和验证
• 1.7 miRNA 在肿瘤生成过程中的作用
• 1.8 miRNA 在低氧情况下的表达及其功能的研究进展
• 1.9 细胞周期，cyclin，CDK 与CKI
• 1.10 Cyclin D1 生成的调节
• 1.11 Cyclin D1 的主要作用机制
• 1.12 Cyclin D1 的其它功能
• 1.12.1 Cyclin D1 对核内激素受体（nuclear hormone receptor）的调控
• 1.12.2 Cyclin D1 对成脂转录因子和脂肪生成（adipogenesis）的调控
• 1.12.3 Cyclin D1 与成肌分化（myogenic differentiation）
• 1.13 Cyclin D1 与肿瘤
• 第2章 研究方法和结果
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验试剂及材料
• 2.1.2 实验器材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养、低氧诱导及转染
• 2.2.2 MTT 染色
• 2.2.3 RNA 的提取及RT-PCR
• 2.2.4 m RNA 逆转录成cDNA
• 2.2.5 重组质粒的构建
• 2.2.6 感受态细胞的转化
• 2.2.7 重组质粒提取后的限制性内切酶消化鉴定
• 2.2.8 突变质粒的构建
• 2.2.9 双荧光酶报告载体检测分析
• 2.2.10 蛋白质印迹
• 2.3 研究方向与意义
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 miRNA 芯片和cDNA 芯片结果分析
• 2.4.2 MTT 法检测低氧情况对CNE 细胞增殖的影响
• 2.4.3 靶点预测
• 2.4.4 MTT 法检测miR-188-5p 对CNE 细胞增殖的影响
• 2.4.5 RT-PCR 检测miR-188-5p 对cyclin D1 的mRNA 表达的影响
• 2.4.6 Western blotting 检测miR-188-5p 对cyclin D1 蛋白表达的影响
• 2.4.7 双荧光实验验证预测位点的正确性
• 第3章 结论与讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果