论文摘要
目的：探讨喜树碱类衍生物与celecoxib联合用药的体外和体内的抗肿瘤作用及机制，同时观察celecoxib对CPT-11引起裸鼠腹泻及体重的影响。方法：以MTT法检测结肠癌细胞系在联合应用celecoxib后对喜树碱及其衍生物的化学敏感性的改变；流式细胞术检测celecoxib与喜树碱联合用药后HT-29细胞的凋亡比率和细胞周期的变化；Western Blot法检测环氧合酶-2（COX-2）以及凋亡相关蛋白（Bcl-2、Caspase-3、P53）的表达。以HT-29细胞裸鼠移植瘤模型观察celecoxib与CPT-11联合应用的体内抗肿瘤作用，并且观察celecoxib对CPT-11引起腹泻及体重减轻的影响。结果：Celecoxib可以显著降低三种喜树碱类衍生物对四种人结肠癌细胞系的IC50值，并且这种降低的程度与COX-2的表达密切相关。在HT-29细胞，celecoxib和CPT的联合应用使其凋亡率达到51.4％，而CPT单独使用的凋亡率为24.4％（p＜0.01）。同时，celecoxib可以使CPT处理组的G0／G1期细胞增加并降低S期和G2／M期的细胞比例（p＜0.01）。Celecoxib和CPT的联合应用可以降低COX-2和Bcl-2的表达，增加Caspase-3和P53的表达。HT-29细胞裸鼠移植瘤实验中，celecoxib（60mg／kg）与CPT-11（25mg／kg）的联合应用使肿瘤生长明显抑制，其抑制率为78.77％(与对照组相比（p＜0.01），与CPT-11（25mg／kg）组相比也有显著差异（p＜0.05）。同时celecoxib可以明显减轻CPT-11引起腹泻症状，降低其腹泻评分（p＜0.01），并降低腹泻的发生率（p＜0.05）；另外，celecoxib可以明显缓解CPT-11引起的裸鼠体重减轻（p＜0.05）。结论：Celecoxib可以增强CPTs的体外、内的抗肿瘤活性，这种作用可能与增加细胞凋亡和细胞周期阻滞作用有关。另外celecoxib可以减轻CPT-11引起的腹泻，并缓解CPT-11引起的体重下降。恶性肿瘤的生长和转移与肿瘤区域的血管密切相关，肿瘤区域的新生毛细血管是肿瘤赖以生长和生存的物质基础，肿瘤细胞需要新生血管为迅速生长的肿瘤提供营养和排出代谢废物。早在七十年代初就有人提出把抑制肿瘤血管形成作为肿瘤治疗的一个途径，随后这种以肿瘤血管为靶标的治疗策略——肿瘤血管靶向治疗（Tumor vascular targeting therapy）逐步发展成为当今肿瘤领域研究的主攻方向之一。因此肿瘤血管生成的分子基础也成了当今肿瘤生物学与分子生物学研究中最活跃的领域。大量研究表明，VEGF／VEGF-R信号传导通路在肿瘤血管生成中占有非常重要的地位，本研究的第二部分就是围绕血管生成过程中的关键性的信号传导通路展开，以寻找新型的血管生成抑制剂。本部分内容包括两个方面，其中第一方面研究了新型的VEGF-R抑制剂——苯胺酞嗪类化合物FVE-3的抗血管生成作用。第二方面探讨了RXR选择性激动剂LGD1069的抗肿瘤作用以及对肿瘤诱导的血管生成的影响。结果如下：一、新型苯胺酞嗪类化合物FVE-3的抗肿瘤及抗血管生成作用1、FVE-3的抗肿瘤作用在体外研究中，FVE-3可抑制多种不同来源的肿瘤细胞的生长，如人结肠癌细胞HT-29、HCT-8，人卵巢癌细胞A2780，人胃腺癌细胞BGC-823，人非小细胞肺癌细胞A549，人宫颈癌细胞HeLa，人乳腺癌细胞MCF-7，人黑色素瘤细胞A375，人脐静脉内皮细胞HUVEC和ECV／304以及小鼠黑色素瘤B16、B16-BL6以及转染MEKK1基因的细胞m1B16及空载体细胞pB16等，MTT法测得其半数抑制浓度IC50在2.25～9.17μmol／L之间。用SRB方法观察了FVE-3对三株人结肠癌细胞系HT-29、HCT-8和HCT-116细胞生长的影响，结果表明FVE-3可不同程度地抑制这三种结肠癌细胞系的生长，其半数抑制浓度GI50在1.06～4.3μmol／L之间。同时FVE-3还可以剂量依赖性地抑制结肠癌细胞HT-29和HCT-8的集落形成能力。体内研究表明，FVE-3对小鼠Lewis肺癌及肝癌H22的生长均有一定的抑制作用，并呈一定的剂量效应关系，抑制率分别为28.0％（p＜0.05）、53.6％（p＜0.01）和45.1％（p＜0.05）、50.4％（p＜0.01）。在人结肠癌细胞HT-29和HCT-116裸鼠移植瘤模型中，FVE-3与阳性对照药PTK787均可使裸鼠肿瘤生长明显减慢，肿瘤重量显著降低。其对HT-29抑制率分别为30.4％和43.5％（p＜0.05）；对HCT-116的抑制率分别为39.7％和42.0％（p＜0.05）。2、FVE-3的抗血管生成作用在体外，FVE-3可以抑制人脐静脉内皮细胞ECV／304和HUVEC的增殖，SRB法的结果表明，其GI50分别为4.38和1.11μmol／L。对于ECV／304和HUVEC细胞体外管腔形成能力以及ECV／304体外侵袭能力，FVE-3均具有明显的抑制作用。在体内，中空纤维法分析了FVE-3对肿瘤诱导的血管生成的影响，结果表明FVE-3具有抗血管生成作用，并且呈现一定的剂量效应关系。另外，对人结肠癌HCT-116细胞裸鼠移植瘤免疫组织化学分析表明，FVE-3可以明显抑制内皮细胞表面标志分子CD31的表达。RT-PCR及Western blot分析结果表明，FVE-3可明显下调VEGF-R2的基因表达及蛋白活化，并降低其下游激酶ERK的活性。此外，FVE-3还可以降低COX-2蛋白的表达，其原因可能也与ERK的活性降低有关。二、RXR选择性激动剂LGD1069的抗肿瘤及抗血管生成作用1、LGD1069的抗肿瘤作用LGD1069在体内和体外均具有一定的抑制肿瘤增殖作用。首先，采用MTT法、SRB法观察了LGD1069在体外对肿瘤细胞增殖的作用，发现其IC50和GI50均在10-5 mol／L水平，而生长曲线和克隆形成法的结果表明LGD1069可剂量依赖性地抑制人非小细胞肺癌细胞A549和人卵巢癌细胞A2780的生长和集落形成能力。在体内，LGD1069不仅对鼠源肿瘤生长有明显的抑制作用，而且在人非小细胞肺癌裸鼠移植模型中也表现出明显的抗肿瘤作用。对于小鼠Lewis肺癌，LGD1069小、大两个剂量的抑制率分别为27.1％（p＜0.01）和43.1％（p＜0.01），而对于小鼠宫颈癌U14其抑制率分别为36.7％（p＜0.05）和40.9％（p＜0.01）。LGD1069可显著抑制A549移植瘤的生长，其生长曲线明显下移，瘤体积显著减小；瘤重也显著降低，其中60mg／kg组与对照组相比有显著差异（p＜0.05），两个剂量组的抑制率分别为53.46％和64.22％。2、LGD1069抗肿瘤作用机制研究2．1 LGD1069诱导肿瘤细胞凋亡流式细胞术结果表明，LGD1069可以剂量依赖性地诱导A549细胞凋亡。10μmol／L、20μmol／L、40μmol／L LGD1069处理组的细胞凋亡比例分别为10.47％、15.73％、25.17％，与对照组（3.37％）相比均有显著差异（p＜0.01）。DNA Ladder实验也表明LGD1069诱导细胞凋亡的作用。Western Blot分析表明，LGD1069可以显著抑制凋亡相关蛋白Bcl-2表达，上调Caspase-3的表达。这一结果提示，诱导肿瘤细胞凋亡可能是LGD1069的抗肿瘤作用的机制之一。2．2 LGD1069抗血管生成作用及其机理研究对于肿瘤诱导的血管生成，LGD1069无论在体外还是在体内均有显著的抑制作用。LGD1069对人胚胎脐静脉血管内皮细胞ECV／304的增殖具有一定的抑制作用，MTT法及SRB法测得其半数抑制浓度与在肿瘤细胞相当，在10-5 mol／L水平。同时LGD1069还可以影响ECV／304细胞在Matrigel上的管腔形成能力，7.5、15和30μmol／L LGD1069处理ECV／304细胞24h，其管腔形成率分别为72.8％（p＜0.05）、30.8％（p＜0.01）和13.2％（p＜0.01）。中空纤维法分析了LGD1069对肿瘤诱导的血管生成的影响，结果表明LGD1069具有抗血管生成作用，并且呈现一定的剂量效应关系。另外，对人非小细胞肺癌裸鼠移植瘤的组织学分析结果也表明，LGD1069可以抑制肿瘤诱导的血管生成。RT-PCR以及ELISA实验结果表明，LGD1069可以抑制A549细胞VEGF基因表达和VEGF产生。提示，LGD1069的抗血管生成作用可能与其抑制VEGF分泌有关。Western Blot分析表明，LGD1069可以显著抑制ERK1／2和JNK的磷酸化，提示VEGF表达下降可能与这两种激酶的活化降低有关。在重组基底膜侵袭实验中，7.5、15、30μmol／L LGD1069使ECV／304细胞的侵袭能力分别降低38.7％（p＜0.05）、65.1％（p＜0.01）及85.8％（p＜0.01）；另外，LGD1069可以显著降低内皮细胞与基底膜成份Matrigel的粘附率，其中15和30μmol／L LGD1069处理组的黏附率分别下降为78.2％（p＜0.05）和25.6％（p＜0.01）。RT-PCR结果提示，LGD1069可以显著上调三种RXR亚型的mRNA表达，同时降低侵袭、转移相关的蛋白水解酶uPA、MMP-2，促进TIMP-1的基因表达水平。提示，LGD1069可能具有一定的抗侵袭转移能力，这种作用可能与其受体激动有关。总而言之，论文第二部分从血管生成过程中VEGF／VEGF-R信号传导通路的两个关键环节入手，寻找新型血管生成抑制剂。结果发现，定向合成的新型苯胺酞嗪类化合物FVE-3可以产生明显的血管生成抑制作用，在基因水平、蛋白水平降低VEGF-R的表达与活化。RXR选择性激动剂LGD1069可以显著降低肿瘤细胞产生VEGF，从而影响肿瘤诱导的血管生成，其机制可能与ERK、JNK的活化降低有关。
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