轴突导向因子-1对胎盘血管形成作用的研究

论文摘要

胎盘是母体与胎儿之间进行气体交换、营养物质供应、排除代谢产物的器官。在妊娠过程中,胎盘血管承担着胎儿全部的血供需求,对胎儿宫内发育起着极其重要的作用。胎盘血管形成障碍可导致妊娠结局不良,其中包括大多数的围生期胎儿的并发症,如胎儿生长受限（fetal growth restriction FGR）、胎儿窘迫、早产,以及远期的胎儿并发症如小脑发育不良,而且还与母体的妊娠高血压疾病有关。因此研究胎盘血管形成无疑具有重要的意义。研究表明,血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor VEGF）、纤维母细胞生长因子（fibroblast growth factor FGF）、血管肽素（angipoietin ANG）等均参与胎盘血管形成。除了这些传统的因子,一些新的血管形成调节因子正在被逐步发掘。Netrin-1是一类高度保守的层粘连蛋白相关分子,属于netrins家族,其作为经典的神经导向因子而闻名。由于神经和血管的生长方式十分相似,它们均是层次有序的网络结构,并沿着相同的路线,相互依赖。因此,这使人们对netrin-1在血管中的作用产生浓厚兴趣。研究发现,netrin-1具有与VEGF相同的促血管生成作用,是一种正向血管生成调节因子。但也有不少研究显示了不同的结果,认为在血管生长和形成的过程中,netrin-1是作为一种排斥信号存在的。因此,netrin-1在血管形成中的作用尚不明确。而且,在母体中胎盘是唯一无神经分布但富含血管的组织,netrin-1是否参与胎盘血管的形成和发育呢?本研究通过细胞和分子生物学技术研究netrin-1在胎盘血管发育中的作用,为探索胎盘血管发育寻找新的研究途径,并为增加胎盘血供提供新的理论依据。第一部分轴突导向因子-1在血管生成模型中的作用研究目的：由于神经和血管的生长发育过程有很大相似性。Netrin-1作为经典的神经导向因子,其在血管生成中具有的作用无疑令人关注。尽管有实验证实了netrin-1促血管生成的作用,但也有不少研究显示了相反的结果。Netrin-1在血管生成中的确切作用尚不明确,还存在不少争论。而且这些研究大部分都集中在体外培养模型上。体外培养模型因为不能模拟体内复杂血管生成过程,有其一定的局限性。因此,本研究拟利用离体和在体血管生成模型,模拟的条件更接近体内环境,也更为接近机体的生理状态,进一步阐明netrin-1与血管生成之间的联系。方法：1.离体大鼠动脉环实验：取SD大鼠,无菌条件下切取胸主动脉,立即放入DMEM液中清洗,在解剖显微镜观察下,脉管外纤维和脂肪组织。切取1mm长的动脉环,用DMEM液冲洗数遍。在孔板内加入Matrigel做铺垫。再加入正在凝结的Matrigel,立即放入动脉环,37℃内放置30 min,后分别加入含10、50、100ng/mL netrin-1的无血清培养液,37℃C、5%C02孵育箱内培养,倒置显微镜下观察计数微血管样结构的数量。2.活体内Matrigel plug实验：取雄性C57／BL6小鼠,分为对照组和netrin-1组,分别沿腹膜正中线注射50 U／mL肝素和0.5 m1的Matrigel（对照组含PBS, netrin-1组含50ng/mL netrin-1）。7天后处死小鼠,取出Matrigel plug,照相。分析Matrigel plug内的血红素值水平。4%多聚甲醛固定、包埋、切片,采用免疫荧光染色法检测CD34的表达。结果：1.离体大鼠动脉环实验结果表明,加入10 ng/mL,50 ng/mL和100 ng/mL netrin-1各组血管生成数量发分别为186.29+35.77,291.50±52.47,267.12±44.93均多于对照组56.25±10.79,差异有显著性（P<0.05）。其中50 ng/mL netrin-1促血管生成效应最为显著。2.进一步用50 ng/mL netrin-1做活体内Matrigel plug实验。结果显示,包含有netrin-1的Matrigel plug转变为红色,阴性对照组未见明显变色。血红素值分析结果显示,含有netrin-1的Matrigel plug的血红素值为53.4±7.3,大于对照组（5.8±0.9）,差异有极显著性（P<0.01）。用血管内皮标记物CD34抗体行Matrigel plug切片免疫荧光染色,含有netrin-1的Matrigel plug内可见血管样结构,对照组中未见。结论：Netrin-1作为一种神经轴突导向因子,其在离体和在体血管生成模型中均具有促血管生成效应,是一种有效的血管生成因子。第二部分胎盘微血管内皮细胞的分离与鉴定目的：由于胎盘微血管内皮细胞是构成胎盘屏障的主要成分之一,不仅具有调节血管通透性、进行物质交换和代谢、免疫调节等相关的作用,而且还是胎盘血管形成发育以及相关疾病发生发展的关键因素。大量研究资料表明,微血管内皮细胞不同于大血管内皮细胞,其在许多病理生理过程中起着关键性的作用。采用不同器官或组织来源的微血管内皮细胞研究相关发病机制已经成为非常有价值的技术方法。因此,为了探讨netrin-1在胎盘血管形成中的作用,本研究拟采用酶消化和不连续Percoll密度梯度离心法分离人胎盘微血管内皮细胞。方法：1.分离人胎盘微血管内皮细胞：无菌留取自愿人工流产的健康孕妇绒毛组织,用预冷的含抗生素生理盐水冲洗两次。留取三级绒毛或是绒毛末端。将组织剪碎经过Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型Dispase酶、Ⅰ型DNA酶和胰酶消化后,将所得消化液经筛网过滤,收集滤液,离心,收集沉淀,用DMEM培养液重悬细胞,重悬液贴管壁缓慢加入25%、30%、35%不连续Percoll梯度中,离心后收集距离液而1.5-2.0cm的白色絮状层,加入DMEM培养液重悬接种于培养瓶。2.免疫荧光染色鉴定细胞：传代后,制备细胞爬片,用vWF行免疫荧光染色。爬片用预冷的4%多聚甲醛固定。加正常山羊血清封闭30 min,倾去。加vWF多克隆抗体,40C孵育过夜。用FITC绿色荧光标记IgG二抗湿盒内孵育1 h,荧光显微镜下观察。3. RT-PCR鉴定细胞：根据报道,TLX1和TLX2等同源基因在胎盘微血管内皮细胞和大血管内皮细胞中的表达有明显差异,这种差异可作为区分两者的方法之一。本研究利用RT-PCR检测TLXl、TLX2 mRNA在所分离细胞中的表达情况。总RNA的提取按照Total RNA Extraction Miniprep system说明进行,用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录合成cDNA。结果：1.倒置显微镜下观察培养细胞形态发现,原代培养的胎盘微血管内皮细胞形态和大小差异很大,可呈纺锤形、三角形或不规则形等多种形态。传代细胞初种时悬浮在培养液中,为明亮的圆球形,培养数小时后细胞即可贴壁,7天后细胞能增殖铺满培养瓶底,表现为明显“铺路石”征。2.vWF免疫荧光检测,结果显示,细胞胞浆发绿色荧光,呈阳性表达。证实分离培养的细胞为血管内皮细胞。3. TLX1 mRNA在所分离的细胞中表达量（0.612±0.023）与人脐静脉内皮细胞（0.074±0.011）比较差异十分显著（P<0.01）；TLX2 mRNA在所分离的细胞中表达量（0.579±0.01）与人脐静脉内皮细胞（0.105+0.017）比较差异显著（P<0.05）,证实分离的细胞为胎盘微血管内皮细胞,而不是大血管内皮细胞。结论：成功分离并培养人胎盘微血管内皮细胞。第三部分轴突导向因子-1对胎盘微血管内皮细胞功能的影响目的：Netrin-1作为第一个被鉴定出来的可溶性神经轴突导向因子,其在神经导向和迁移形成中发挥重要作用。近年来,netrin-1在血管生长发育过程中的功能备受关注。胎盘血管床作为母体和胎儿进行物质交换的主要途径,承担着妊娠过程中胚胎和胎儿全部的血供需求。胎盘血管的良好发育对胚胎和胎儿宫内发育起着极为重要的作用。我们前期的研究证实,netrin-1在胎盘中表达并与胎盘血管床密度呈正相关。为了进一步阐明netrin-1与胎盘血管的关系,本研究拟通过细胞实验观察其对胎盘微血管内皮细胞功能的影响,以期了解netrin-1在胎盘血管形成发育过程中的作用。方法：1.MTT：将细胞分为4组,分别为空白对照组、10 ng/mL netrin-1组,50 ng/mL netrin-1组和100 ng/mL netrin-1组,接种于48孔板内,常规培养24 h后每孔加入5mg/mLMTT,置于37℃培养箱中继续培养4h后,终止培养,每孔加入DMSO溶液150μl,充分振荡10 min,使结晶充分溶解,酶标仪检测570nm处各孔吸光值。2.迁移试验：于Transwell小室上层加入含netrin-1浓度分别为10、50和100 ng/mL的无血清培养液,同时加入0.1 ml细胞悬液,细胞浓度为3×105/mL,置于370C、5%C02培养箱中培养6 h,取出Transwell小室,用棉签擦去上室面的细胞,台盼蓝染色,显微镜下随机5个视野计数下室面细胞。3.管腔形成试验：将细胞用DMEM培养液重悬,接种于包被有Matrigel （300μl）的24孔培养板中,分别加入10、50和100 ng/mL netrin-1,置于37℃C、5%C02培养箱中培养8h后倒置相差显微镜下观察,以形成的管腔数量表示不同netrin-1浓度下细胞形成管腔的能力。4.凋亡检测：用10、50、100 ng/mL netrin-1处理细胞48 h后,将培养液倒入离心管,贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化,制成单细胞悬液,与培养液中收集的悬浮细胞一起离心,弃上清,沉淀的细胞以PBS洗两遍,最后留少许液体重悬,振荡条件下逐渐滴加入预冷的70%乙醇5 ml,4℃保存待测。测定前用PBS洗去乙醇,加入PI染液,室温下避光染色30 min后,用流式细胞仪分析细胞的凋亡,计算各组细胞调亡率。结果：2.MTT实验结果显示netrin-1浓度为10、50和100ng/mL时吸光值分别为0.3244±0.02、0.503±0.019和0.447±±0.032,与对照组（0.203±±0.012）比较,均有差异显著性（p<0.05、p=0.01或p<0.01）。3. Netrin-1浓度为10、50和100ng/mL时,迁移细胞数分别为15.6±±0.5、20.8±±0.9和19.6±±0.2,均明显多于对照组9.44±0.4（p<0.05或p<0.01）。4.在10、50和100ng/mL浓度的netrin-1作用下,实验组细胞形成管腔的数量分别为13+1、144±2和19±±2,与对照组（8±±1）比较,p均<0.05。5.流式细胞仪检测和分析结果显示,随着netrin-1浓度增加,细胞凋亡率呈递减趋势（38.5±4.2、29.3±3.2和17.9±2.6）,对照组细胞凋亡率为51.4±6.9,差异有显著性（p<0.05）。结论：一定浓度的netrin-1可促进胎盘微血管内皮细胞的增殖活力、迁移能力和管腔形成能力,并抑制细胞的凋亡,提示netrin-1是促胎盘血管形成因子之一,可能用于治疗胎盘血管形成不良。

论文目录

• 前言
• 参考文献
• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 轴突导向因子-1在血管生成模型中的作用研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 胎盘微血管内皮细胞的分离与鉴定
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 笫三部分 轴突导向因子-1对胎盘微血管内皮细胞功能的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 全文小结
• 综述
• 参考文献
• 缩略语表
• 研究生期间发表的论文情况
• 致 谢