五指山猪近交系EG细胞建系影响因素研究

论文摘要

本实验以五指山小型猪（WZSP）近交系为实验材料,先后由18头妊娠母猪采集了200枚早期胎儿,分别从不同饲养层、条件培养基、是否添加生长因子、传代过程中所用消化液等方面对其EG细胞的建系影响因素进行了研究;并对传代获得的EG细胞集落进行了鉴定。 （1） 从26～28d的新鲜猪胎儿可以获得大量的猪胎儿成纤维细胞（PEF）,经传代培养后即可纯化。实验过程中,PEF传至10代以上,可以在体外长期培养并可冷冻保存。本实验对F5代的PEF进行了核型分析,结果表明其在体外培养核型正常。 （2） 采集26.5d的WZSP胎儿53枚,其中33枚以经丝裂霉素C处理的STO细胞作为饲养层;其余20枚采用未经丝裂霉素C处理的PEF与EG细胞共培养的方式进行培养。在使用同种培养基的条件下,比较不同饲养层对猪的EG细胞分离培养与传代的影响。结果表明,STO细胞适合用作猪EG细胞分离培养、传代的饲养层;而采用PEF与EG细胞共培养的方式只适于原代PGCs的分离培养,传代后,仍需以STO细胞制备饲养层才能维持EG细胞的未分化状态,PEF不能维持EG细胞的传代培养。 （3） 采集26.5d的WZSP胎儿35枚,其中的15枚用BRL条件培养基进行培养;其余20枚以高糖DMEM+15%FCS+2mmol/ml L-谷氨酰胺+0.1mmol/ml非必需氨基酸+0.1mmol/ml β-巯基乙醇+100IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素常规培养基进行培养,研究BRL条件培养基对猪EG细胞培养与传代的影响。结果表明,以STO细胞作饲养层,使用BRL条件培养基与常规培养基在猪EG细胞分离培养、传代后均可获得细胞集落,而且使用BRL条件培养基培养产生的集落数多,细胞生长速度快。因此,BRL条件培养基适于猪EG细胞的培养传代。 （4） 采集26.5d的WZSP胎儿78枚,其中的43枚用常规培养基（培养基Ⅰ）进行培养;剩余35枚在添加LIF、SCF、bFGF三种生长因子的培养基（培养基Ⅱ）中进行培养。研究不添加生长因子对猪的EG细胞分离培养与传代的影响。实验结果表明,以STO细胞作为饲养层,在两种培养基中都能得到可以传代的EG细胞集落。但在培养基Ⅰ中原代EG集落出现时间晚,生长速度较慢,传代时间间隔长,EG细胞形态扁平;而在培养基Ⅱ中原代EG集落很快出现,生长速度较快,传代间隔短。两种培养条件下获得的EG细胞都具有胚胎干细胞的形态和特征。结果提示,以STO细胞作为饲养层,不添加生长因子的培养基也可以维持EG细胞的培养、传代。 （5） 采集26.5d的WZSP胎儿34枚,分离胎儿PGCs,以STO细胞为饲养层,以常规培养基进行培养。在EG细胞传代过程中,分别用dispase和0.25%的Trypsin-EDTA对其进行消化传代,比较两种消化液对传代的影响。结果表明,用两种消化液消化传代都能够获得新的可传代的EG细胞集落。因此,两种消化液均可用于EG细胞的传代培养。 （6） 对培养获得的3～4代的细胞集落进行鉴定,结果表明分离培养的EG细胞形态多样,集落内细胞排列紧密,集落边缘清晰,AKP染色呈强阳性,SSEA-1免疫荧光染色为阳性,Oct-4免疫荧光表达亦为阳性,体外悬浮培养可以形成简单类胚体,具有胚胎干细胞的诸多特征。

论文目录

• 文献综述
• 一、胚胎干细胞的生物学特性
• 二、国内外研究现状
• 三、胚胎干细胞建系的技术路线
• 四、胚胎干细胞的应用价值与前景
• 五、本论文的研究意义
• 实验一 不同饲养层对猪EG细胞分离培养与传代的影响
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 结果与讨论
• 实验二 条件培养基对猪EG细胞培养传代的影响
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 实验三 无生长因子对猪EG细胞培养、传代的影响
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 实验四 不同消化液对猪EG细胞传代的影响
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 实验五 EG细胞的鉴定
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历