大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中细胞自噬及3-甲基腺嘌呤作用的研究

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目的：阻塞大鼠大脑中动脉，复制大鼠局灶性脑缺血模型，观察缺血半暗带细胞所发生的细胞自噬现象。观察该现象及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对神经细胞的作用。方法：1、大鼠局灶性脑缺血模型的复制:采用大脑中动脉阻塞（MCAO）法造成中动脉供血区域局灶性脑缺血，缺血指定时间后恢复脑血流灌注。2、实验分组：①假手术组（sham）：仅手术分离颈总动脉及其分支；②控制组（control）：脑缺血前30min经脑室注射0.6μL0.9%氯化钠注射液，缺血1h、3h后恢复脑血流灌注24h；③3-MA组：脑缺血前30min经脑室注射0.6μL（合约600nmol）3-甲基腺嘌呤溶液，缺血1h、3h后恢复脑血流灌注24h。3、神经行为学评分：采用Longa5分法。4、TTC染色：大鼠脑冠状位切片，将脑片组织置于2%氯化三苯基四氮唑溶液,恒温避光温育，染色后比较脑梗死面积大小。5、HE染色：经左心室灌注固定、取脑石蜡包埋、制作大脑皮层冠状切片、常规HE染色，光镜下观察。6、Western blot：断头取脑，快速分离海马、纹状体、皮层等结构，匀浆并离心后提取蛋白，蛋白定量后进行Western blot检测。实验结论:1、在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中，细胞自噬参与到脑细胞保护当中，自噬对挽救缺血半暗带神经元的死亡方面起着积极的作用。2、3-甲基腺嘌呤作为自噬抑制剂，在脑缺血再灌注时加重了神经元的死亡。3、3-甲基腺嘌呤在脑缺血再灌注时可能的作用机制是：抑制III型PI3K或干扰Bcl-2和Beclin-1的表达。

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第1章绪论

第2章综述

2.1 自噬的概念

2.2 细胞自噬的过程

2.2.1 自噬诱导

2.2.2 自噬体形成

2.2.3 自噬体内容物的降解

2.3 自噬的调控机制

2.3.1 依赖 mTOR（marnmalian target of rapamycin）途径的自噬

2.3.2 依赖磷脂酰肌醇三磷酸激酶（Class III PI3K）途径的自噬

2.3.3 Ras／PKA 通路

2.3.4 AMPK 途径

2.4 自噬和缺血性脑卒中

第3章材料与方法

3.1 材料

3.1.1 主要试剂

3.1.2 主要仪器

3.1.3 动物

3.2 试验方法

3.2.1 试剂制备

3.2.2 模型制备

3.2.3 侧脑室注射 3-甲基腺嘌呤

3.2.4 实验分组

3.2.5 神经行为学评分

3.2.6 TTC 染色

3.2.7 苏木精-伊红（HE）染色

3.2.8 蛋白质印迹杂交 Western blot

第4章结果

4.1 神经行为学评分

4.2 TTC 染色

4.3 苏木精-伊红（HE）染色

4.4 蛋白质印迹杂交

4.4.1 蛋白 LC3-II

4.4.2 蛋白 Bcl-2

4.4.3 蛋白 Beclin1

第5章讨论

5.1 脑缺血再灌注损伤及其机制

5.2 细胞自噬及其作用

5.3 本研究的局限性

第6章结论

参考文献

作者简介及在读期间所取得的科研成果

致谢

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