食管鳞癌中HLA-I类抗原和APM主要分子异常表达与免疫治疗实验研究

论文摘要

我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家。尽管近年来手术和放化疗已取得不少进展,但其5年生存率仍徘徊在15%左右,因此急需寻找新型辅助治疗手段。随着肿瘤免疫学突破性的进展,肿瘤特异性免疫治疗的研究成为最具应用潜力的研究领域。目前虽然已有多种肿瘤疫苗进入临床验证,但大多疗效不尽如人意,其原因与肿瘤细胞中HLA-Ⅰ类抗原和APM分子表达低下或缺失,从而逃逸宿主免疫监视密切相关。宫颈癌、肺癌、头颈鳞癌、卵巢癌和肾癌等肿瘤中已发现这些分子异常表达。但食管癌有关这方面的报道甚少。本文分析食管癌组织和细胞株中HLA-Ⅰ类抗原和APM分子（TAP1等）的表达,并在体内外探讨其表达与食管癌免疫治疗的关系。首先应用组织芯片技术检测食管癌高发区陕西省200例食管组织（120例鳞癌和与其中40例配对的癌旁粘膜上皮和淋巴结转移各40例）中HLA-Ⅰ类抗原和APM分子的表达及HPV感染情况。免疫组化结果显示,在癌旁粘膜上皮中：TAP1全部表达正常；HLA-Ⅰ有50%表达正常,20%表达下调,30%检测不到；β2m有27.5%表达正常,72.5%检测不到,提示HLA-Ⅰ和β2m表达下调是食管癌发生的早期事件。同时配对的食管鳞癌和淋巴结转移组织中HLA-Ⅰ和β2m的表达也严重下调。鳞癌组织中TAP1的表达水平低于癌旁粘膜上皮,高于淋巴结转移组织（P<0.001）,且与肿瘤分化程度显著相关（P<0.05）。TAP1降低程度和肿瘤进展相一致,可作为反映肿瘤转移的参考指标。114／120例食管鳞癌和40／40例淋巴结转移灶癌细胞中至少有一种以上的分子表达水平下调。有淋巴结转移的原发鳞癌组织中HLA-Ⅰ,β2m和TAP1的下调率和丢失率均明显高于无淋巴结转移的肿瘤组织（P<0.05）。原位杂交法检测HPV感染结果表明：40例配对的食管鳞癌、癌旁粘膜上皮和淋巴结转移组织标本中,HPV16／18的检出率分别为57.5%、52.5%和42.5%,提示HPV感染率较高,但各组间无显著差异。进一步分析表明HPV感染与HLA-Ⅰ类抗原及APM主要分子表达情况无显著相关性。由于高危型HPV E6和E7是公认的癌基因和理想的靶抗原,因此推测有可能成为食管癌免疫治疗的靶抗原。食管癌中HLA-Ⅰ类抗原和APM主要分子TAP1表达严重下调,提示可能是食管癌T细胞依赖性免疫治疗的重要障碍之一。为了进一步建立动物模型,观察这些分子的表达与免疫治疗的关系,我们采用流式细胞仪检测发现,4株食管癌（EC9706、KYSE150、KYSE510和NEC）细胞系HLA-Ⅰ类复合物的表达均下调。RT-PCR和Western Blot结果表明,KYSE510细胞中组成型表达TAP2、LMP7、LMP10、PA28a和PA28β基因；而另外3株细胞（EC9706、KYSE150和NEC）中至少一种基因表达下调或缺失；TAP1、β2m和LMP2蛋白在4株细胞系中表达明显下调或缺失；tapasin仅在KYSE150中表达明显下调。IFN-γ可使各基因的异常表达恢复,提示这些基因表达产物的下调或缺失并非由基因结构改变（即硬损伤,hard lesion）所致,是可以经诱导而重新表达,可以直接用于免疫治疗研究。因此,我们选用EC9706细胞株建立了HPV16 E7阳性（靶抗原）,且免疫原性低具高转移能力（即HLA-Ⅰ抗原及APM主要分子表达下调）的人食管癌Hu-PBL-SCID小鼠模型。研究发现在上述模型中,HHP蛋白疫苗能有效的抑制小鼠体内EC9706肿瘤细胞的生长,抑瘤率达55%左右,而且可以明显延长荷瘤小鼠的生存时间。CTL和Elispot结果表明,HHP蛋白免疫组小鼠脾脏中存在大量E6／E7抗原特异性淋巴细胞,并可诱发以EC9706为靶细胞的特异性CTL反应。HE和免疫组化结果表明,HHP蛋白免疫组肿瘤组织中有明显的CD8+T淋巴细胞浸润。同时,HHP蛋白免疫组肿瘤组织中IFN-γ表达水平明显高于对照组,且HLA-Ⅰ类抗原和APM分子（TAP1／2,LMP2,PA28β）表达明显上调。为了进一步证实细胞HLA-Ⅰ类抗原表达上调可增强免疫治疗效果,我们用IFN-γ处理前／后的EC9706细胞作为靶细胞,以三组小鼠脾脏中的人淋巴细胞作为效应细胞进行CTL活性测定,发现与未经处理的细胞相比,HHP蛋白免疫组小鼠脾脏细胞对经IFN-γ处理的食管癌细胞有明显高的杀伤效应（P<0.05）。综上,本研究首次报告我国食管癌高发区陕西省食管癌组织中HLA-Ⅰ类抗原和APM分子TAP1表达明显下调,可能是其免疫逃逸的重要原因之一,且该地区患者HPV感染率较高；建立了HPV阳性、HLA-Ⅰ类抗原和APM分子表达下调的人食管癌Hu-PBL-SCID小鼠模型；HHP融合蛋白疫苗在体内可有效抑制肿瘤生长,且HHP疫苗能显著上调EC9706移植瘤细胞中HLA-Ⅰ类分子和APM主要分子表达。本工作为食管癌的免疫治疗提供了新的实验模型和数据。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 食管鳞癌组织中HLA-Ⅰ类抗原和APM分子表达与HPV感染情况及其意义
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二章 人食管癌Hu-PBL-SCID小鼠模型建立与鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三章 融合蛋白疫苗体内治疗食管癌效果及其与HLA-Ⅰ类抗原的关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结语
• 参考文献
• 文献综述 免疫佐剂研究现状
• 附录 博士在读期间发表/待发文章
• 致谢