粘球菌内源质粒的发现、复制区性质和应用

论文摘要

粘细菌是一类革兰氏阴性杆状细菌,在分类上属于变形菌门的δ分支。粘细菌是一种高等的原核生物,具有复杂的多细胞社会性行为,主要表现为介质表面的滑动运动、复杂的子实体形态发生和细胞生长的密度依赖性,因此粘细菌是研究细菌细胞间通讯、多细胞形态发生和生物进化的重要模式生物。此外粘细菌可以产生丰富多样的具有生物活性的次级代谢产物,已成为继放线菌之后的一类重要的药源微生物。而且粘细菌产生的次级代谢产物具有种类多、结构新、具有菌株特异性、衍生物众多和作用于真核细胞的独特特点,吸引了越来越多不同研究领域的科学家的关注。但是由于粘细菌繁琐费时的分离纯化方法和不完善的遗传操作技术,该微生物的研究和应用受到了极大的限制。由于粘细菌作为生境中的捕食者,细胞内存在大量的蛋白酶和核酸酶,且粘细菌生长存在细胞密度依赖性,对粘细菌进行遗传操作遇到了很多困难。经过过去三十年的研究,常用的遗传学操作方法（转导、转化和接合）已在粘细菌的模式菌株中得到了成功应用。然而在过去近五十年的时间中,科研工作者虽然对粘细菌进行了大规模筛选,但是在各种属细胞中一直没有发现内源性的质粒,而且其他菌目来源的广宿主范围质粒均不能在粘细菌中自主复制,所以粘细菌的遗传学研究受到了极大限制。本论文试图对中国生境内已分离的粘细菌进行筛选,希望能筛选到带有自主复制质粒的粘细菌,并将质粒应用于粘细菌的遗传学研究,建立新的遗传学操作方法。本论文采用放线菌中常用的质粒筛选方法,利用脉冲场电泳和琼脂糖凝胶电泳技术对本实验室分离的150株粘球菌和珊瑚球菌菌株进行线性质粒和环形质粒的筛选。结果显示没有筛选到线性质粒,但在一株Myxococcus fulvus 124802中发现了一个环形的内源质粒pMF1。该菌能形成典型的粘球菌子实体结构,且16s rDNA序列与M.fulvus ATCC 25199的16S rDNA序列具有99%的同源性,中国典型培养物保藏中心保藏号为M 206081。对质粒pMF1亚克隆测序发现,该质粒序列全长18,634 bp,G+C%含量为68.7%。ORF预测显示全序列存在23个可能的ORF,其中21个ORF位于正义链,2个ORF位于反义链;9个ORF与GenBank数据库中的已知序列有较高同源性,其余的14个ORF同源性较低,是未知功能蛋白,没有发现可能的质粒复制起始蛋白。本论文构建了一个带有卡那霉素抗性筛选标记的克隆载体pZJY1,用于在M.xanthus中定位pMF1的质粒复制功能区。结果显示凡是带有pMF1.14基因的质粒,转化M.xanthus的转化子均可以耐受卡那霉素,且存在核外自主复制质粒。质粒的电转化效率高于同源重组质粒的电转化效率,转化M.xanthus DZ1可达到1×106CFU/μg DNA,转化M.xanthus DK1622可达到1×105CFU/μg DNA,推测PMF1.14就是pMF1的质粒复制起始蛋白,而质粒pZJY15中带有的pMF1插入序列（11,645-13,853 bp）可能就是pMF1质粒复制功能区。在E.coli中对pMF1.14基因进行异源表达,结果显示除pQE-30构建的质粒外,其他载体构建的质粒均可使转化子经过诱导产生目的大小的表达产物,以可溶性蛋白和包涵体的形式存在。本论文发现构建的质粒在M.xanthus转化子中结构不稳定,会小于原始质粒大小,通过克隆测序分析发现,质粒中的不稳定区域是E.coli质粒pSP72的复制子与氨苄青霉素抗性基因bla序列,推测E.coli质粒pSP72的复制子与M.fulvus质粒pMF1的复制子在M.xanthus中不能共存。为了解决这个问题,对带有两种复制子质粒的M.xanthus转化子进行了大量筛选,筛选到两个在M.xanthus中结构稳定的质粒pZJY41和pZJY156。而且在抗性筛选压力下,M.xanthus转化子连续传代,两质粒结构依然稳定,克隆测序分析发现两个质粒带有的pMF1插入序列部分均有1个碱基的缺失。本论文在M.xanthus中对穿梭载体pZJY41和pZJY156进行了性质测定,这两个质粒在M.xanthus中均为低拷贝质粒,在M.xanthus DZ1中pZJY41的拷贝数为13左右,pZJY156的拷贝数低于pZJY41;而在M.xanthus DK1622中pZJY41和pZJY156的拷贝数要低于其各自在M.xanthus DZ1中的拷贝数。质粒pZJY41和pZJY156在M.xanthus中的遗传稳定性很差,在没有选择压力的情况下,传代42代后质粒在转化子中的存在率降为5%以下。为提高穿梭载体在M.xanthus中的遗传稳定性,来自质粒pMF1的两个ORF基因pMF1.16（推测的重组酶基因）和pMF1.22（推测的分配蛋白parA基因）克隆入两个穿梭载体,获得的质粒在M.xanthus中的遗传稳定性依然很差,推测自主复制质粒在M.xanthus中的分配可能依赖其他机制或蛋白的作用。构建的带有pMF1复制子的接合质粒接合入Sorangium cellulosum So0157-2,与同源重组质粒相比接合效率提高10-100倍,但是质粒的遗传稳定性非常差,推测与S.cellulsoum中更为严格的限制修饰系统相关。为将pZJY41和pZJY156这两个穿梭载体应用于粘细菌的遗传学研究,本论文开展了两方面的工作,试图在粘细菌中建立一套新的遗传操作方法。粘细菌的滑动运动在Myxococcus xanthus中研究得较为成熟,受双运动系统控制:细胞的群体运动（S运动）和细胞的个体运动（A运动）。两种运动在含有不同浓度琼脂的平板表面表现出不同的选择优势,易于区分。其中细胞的群体运动机制研究得较为透彻,主要依赖细胞表面的Ⅳ型菌毛、胞外纤丝和脂多糖O抗原三种组分。S运动的动力元件是Ⅳ型菌毛,依靠Ⅳ型菌毛的伸展、粘附、收缩拉动细胞共同运动,而pilA基因是菌毛pili的结构基因。本论文将M.xanthusDK1622来源的pilA基因及上游的σ54启动子序列克隆入穿梭载体pZJY41和pZJY156构建功能质粒,转化pilA基因缺失的S运动缺失突变体M.xanthusDK10410。通过透射电镜观察,转化子细胞极处长出pili;运动学实验表明,转化子S运动表型恢复。实验表明应用穿梭质粒时,克隆目的基因的转录方向与pMF1质粒复制起始蛋白的转录方向必须一致,M.xanthus转化子中质粒结构稳定。该实验证明穿梭载体pZJY41和pZJY156可以成功应用于粘细菌的遗传学研究,在M.xanthus中建立了以核外质粒形式回补缺失基因的新的遗传学操作方法。氨基糖甙类抗生素是一种重要的临床药用抗生素,微生物对氨基糖甙类抗生素产生的抗性机制除了常见的改变细胞通透性、活性外排、靶点核酸替换及三种修饰氨基糖甙类抗生素的酶失活抗生素以外,又发现了一类对rRNA修饰的酶:16S rRNA甲基化酶和16S rRNA甲基转移酶。这类酶可以使细胞对氨基糖甙类抗生素产生广谱抗性,多由氨基糖甙类抗生素的产生菌株编码产生,对rRNA甲基化修饰破坏抗生素与核糖体亚单位中16S rRNA的特异性结合。近年来该酶也在一些氨基糖甙类抗生素耐药菌中发现。粘细菌可以对多种抗生素产生抗性,多表现为菌株特异性,而S.cellulosum对氨基糖甙类抗生素——卡那霉素的耐受性具有种特异性,但由于粘细菌中有限的遗传学研究方法,该抗性机制的遗传学基础一直没有阐明,本论文试图利用pMF1复制子在M.xanthus中研究真S.cellulosum对卡那霉素具有内源抗性的遗传学基础。本论文构建了一个在M.xanthus中没有筛选标记但带有pMF1复制子的克隆载体pZJY42,将不完全酶处理的S.cellulosum So0157-2的染色体片段克隆入pZJY42转化M.xanthus DZ1,在卡那霉素抗性平板上筛选到5株M.xanthus转化子。对克隆序列进行序列测定和组装,得到5.4 kb的S.cellulosum基因组片段,且各转化子中均带有一段2.4 kb的共有序列。对卡那霉素抗性基因进行基因定位,发现该基因是一个推测的rRNA甲基转移酶基因,位于一个672 bp的基因位点kmr（kanamycin resistance）。凡是带有该位点的质粒均能使M.xanthus转化子对卡那霉素、庆大霉素、阿布拉霉素、新霉素和妥布霉素产生高水平的抗性（大于500μg/ml）。但是带有该位点的质粒却不能使E.coli转化子对卡那霉素产生抗性,推测可能由于该基因的启动子序列不能为E.coli识别转录,或基因中带有的E.coli稀有密码子不能有效翻译。在S.cellulosum基因组序列中,kmr位点下游存在一个推测的整合酶基因,可能帮助kmr在S.cellulosum种间传播。利用16S rRNA甲基转移酶保守区设计的引物从13株S.cellulosum菌株中扩增得到同源性非常高的kmr序列片段。对已报导的16S rRNA甲基转移酶和16S rRNA甲基化酶序列进行进化关系分析,发现S.cellulosum来源的rRNA甲基转移酶基因独立形成一个分支,结合该酶对氨基糖甙类抗生素特殊的抗性谱,推测S.cellulosum来源的rRNA甲基转移酶可能是rRNA甲基转移酶家族的一个新成员。

论文目录

中文摘要

ABSTRACT

符号说明及缩写词

第一章文献综述

1.1 粘细菌简介

1.2 粘细菌的遗传学研究

1.2.1 粘细菌的分子生物学操作方法

1.2.2 粘细菌来源或可以应用于粘细菌的噬菌体

1.2.3 在粘球菌中应用的转座子

1.2.4 粘细菌的遗传学研究

1.2.5 粘细菌的基因组学研究

1.3 环形质粒的类型及复制机制

1.3.1 θ复制

1.3.2 链置换复制

1.3.3 滚环复制

1.4 Myxococcus xanthus细胞的群体运动

1.4.1 粘细菌的滑动运动

1.4.2 M.xanthus群体运动机制

1.4.3 M.xanthus群体运动机制相关基因

1.5 细菌对氨基糖甙类抗生素耐受机制

1.5.1 氨基糖甙类抗生素性质介绍

1.5.2 细菌对氨基糖甙类抗生素的耐受机制

1.6 本论文工作开展思路和研究内容

第二章粘球菌内源质粒的发现和复制区性质分析

2.1 实验材料与仪器试剂

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 主要培养基

2.1.3 主要实验试剂

2.1.3.1 常用溶液

2.1.3.2 常用试剂盒、限制性内切酶和抗生素

2.1.4 主要仪器设备与耗材

2.1.5 数据库及分析软件

2.2 实验方法

2.2.1 粘细菌环形质粒的检测

2.2.2 粘细菌线性质粒的检测

2.2.2.1 胶块制作

2.2.2.2 脉冲场电泳检测

2.2.3 粘细菌总DNA提取

2.2.4 菌株124B02的性质测定

2.2.4.1 菌株124B02营养细胞大小测定

2.2.4.2 菌株124B02粘孢子大小测定

2.2.4.3 菌株124B02球形子实体的拍照观察

2.2.4.4 菌株124B02球形子实体的扫描电镜观察

2.2.4.5 粘细菌染色体DNA提取

2.2.4.6 菌株124B02的16S rDNA序列测定

2.2.5 菌株124B02的保藏

2.2.6 环形质粒pMF1的亚克隆测序

2.2.6.1 E.coli感受态细胞的制备

2.2.6.2 连接产物或质粒转化E.coli方法

2.2.6.3 E.coli转化子质粒提取

2.2.6.4 PCR产物或酶处理体系纯化

2.2.6.5 质粒pMF1的亚克隆

2.2.7 质粒pMF1序列分析

2.2.8 质粒pMF1复制功能区的定位

2.2.8.1 克隆载体pZJY1的构建

2.2.8.2 同源重组质粒pK1的构建

2.2.8.3 粘球菌电转化流程

2.2.8.4 质粒pMF1复制功能区的定位

2.2.9 pMF1.14基因在E.coli中异源表达

2.2.9.1 表达质粒制备

2.2.9.2 pMF1.14基因在E.coli中异源表达

2.2.9.3 检测异源表达蛋白是否形成包涵体

2.2.10 M.xanthus DK1622染色体复制区oriC的探索

2.2.11 Sorangium cellulosum So0157-2染色体复制区oriC探索

2.2.11.1 粘细菌染色体提取方法

2.2.11.2 S.cellulosum So0157-2染色体复制区oriC的克隆

2.3 实验结果与讨论

2.3.1 粘细菌中自主复制质粒的筛选

2.3.1.1 粘细菌中环形质粒的筛选

2.3.1.2 粘细菌中线性质粒的筛选

2.3.2 菌株124B02的种属鉴定

2.3.3 质粒pMF1的亚克隆测序及序列分析

2.3.4 质粒pMF1复制功能区定位

2.3.5 pMF1.14基因在E.coli中异源表达

2.3.6 粘细菌中染色体复制区oriC的探索

2.3.6.1 M.xanthus DK1622染色体复制区oriC的探索

2.3.6.2 S.cellulosum So0157-2染色体复制区oriC的探索

2.4 本章小结

第三章大肠杆菌——粘球菌穿梭载体的构建和性质分析

3.1 实验材料与仪器试剂

3.1.1 菌株和质粒

3.1.2 主要培养基

3.1.3 主要实验试剂

3.2 实验方法

3.2.1 E.coli受体菌对M.xanthus转化子中质粒结构稳定性的影响

3.2.2 测序验证M.xanthus转化子中变小质粒的丢失序列区域

3.2.3 构建质粒验证M.xanthus中质粒结构不稳定区域

3.2.4 从M.xanthus转化子中筛选结构稳定的穿梭质粒

3.2.5 确证穿梭质粒pZJY41和pZJY156序列改变的位点

3.2.6 质粒拷贝数测定

3.2.7 质粒遗传稳定性测定

3.2.8 提高穿梭载体遗传稳定性的探索

3.2.9 构建可在E.cooi——S.cellulosum中应用的穿梭载体

3.2.9.1 E.coli——S.cellulosum接合操作

3.2.9.2 E.coli——S.cellulosum穿梭载体的构建

3.3 实验结果与讨论

3.3.1 构建在E.coli——M.xanthus中可以应用的结构稳定的穿梭载体

3.3.1.1 使用不同基因型的E.coli宿主细胞

3.3.1.2 鉴定M.xanthus转化子中质粒结构不稳定区域

3.3.1.3 筛选M.xanthus转化子得到结构稳定的穿梭载体

3.3.2 穿梭质粒在M.xanthus中拷贝数测定

3.3.3 穿梭质粒在M.xanthus DZ1中遗传稳定性测定

3.3.4 提高穿梭载体遗传稳定性的探索

3.3.5 E.coli——S.cellulosum穿梭载体的构建

3.4 本章小结

第四章大肠杆菌——粘球菌穿梭载体的应用

4.1 实验材料与仪器试剂

4.1.1 菌株和质粒

4.1.2 主要培养基

4.1.3 主要实验试剂

4.2 实验方法

4.2.1 S运动缺失突变体运动表型回补

4.2.1.1 质粒pZJY24和pZJY25的构建

4.2.1.2 M.xanthus的滑动运动测定

4.2.1.3 M.xanthus细胞表面结构pili的透射电镜观察

4.2.2 S.cellulosum卡那霉素抗性基因的克隆、鉴定及分析

4.2.2.1 S.cellulosum卡那霉素抗性基因的克隆

4.2.2.2 S.cellulosum卡那霉素抗性基因的定位

4.2.2.3 氨基糖甙类抗生素的MIC测定

4.2.2.4 探索kmr在S.cellulosum中存在普遍性

4.2.2.5 16S rRNA甲基转移酶和16S rRNA甲基化酶序列进化关系分析

4.3 实验结果与讨论

4.3.1 S运动缺失突变体运动表型回补

4.3.1.1 质粒构建和转化

4.3.1.2 M.xanthus转化子S运动表型观察

4.3.1.3 M.xanthus细胞表面结构pili的透射电镜观察

4.3.2 S.cellulosum卡那霉素抗性基因的克隆、鉴定和分析

4.3.2.1 S.cellulosum卡那霉素抗性基因的克隆

4.3.2.2 S.cellulosum基因组卡那霉素抗性基因的定位

4.3.2.3 rRNA甲基转移酶在其他S.cellulosum中存在的普遍性

4.3.2.4 16S rRNA甲基转移酶和16S rRNA甲基化酶序列进化关系分析

4.3.2.5 M.xanthus转化子对氨基糖甙类抗生素MIC测试

4.4 本章小结

创新性与展望

附录

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

学位论文评阅及答辩情况表

外文论文

粘球菌内源质粒的发现、复制区性质和应用

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