稻瘟病菌T-DNA插入致病突变体筛选及分析

论文摘要

稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr.,无性世代为Pyricularia grisea（Cooke）Sacc.]侵染水稻引起的稻瘟病是水稻“三大病害”之一,每年给水稻生产带来重大的经济损失。由于稻瘟病菌的致病性复杂多样。因此只有深入了解稻瘟病菌的致病性及其变异机制,为培育持久抗瘟的水稻品种、制定更加行之有效的防治策略奠定良好的理论基础。本研究通过活体接种和离体接种两种方法接种6个CO39近等基因系水稻品种（C039 NILs）即C101LACPi-1（t）、C101A51Pi-2（t）、C104PKTPi-3（t）、C101PKTPi-4a、C101TTP-4L-23Pi-4b和CO39。筛选本实验室已建成的利用ATMT技术获得的稻瘟病菌T-DNA插入突变体库,获得3个致病性变异稳定的突变体T940084602、T940017403、T940077801,并对这3个突变体进行相关致病性分析。这3个突变体表现出对C101LACPi-1（t）、C101PKTPi-4a致病性增强。通过表型分析,发现致病性增强突变体在生长速度、产孢量、孢子萌发率以及附着胞形成率同野生型比较无较大区别,推测T-DNA插入可能对这3个突变体在生长速度、产孢量、孢子萌发率等表型上无影响。用分子遗传方法对这3个致病性变异的突变体进行了分析。通过普通PCR验证表明,它们都含有潮霉素磷酸转移基因。同时,运用TAIL-PCR方法获得了这3个突变体的T-DNA侧翼序列,其中T940017403同稻瘟病菌基因组Supercontig183的719459 bp～720010 bp同源,T-DNA插入位点在基因MGG.07908.5的碳端区域,该基因编码Glycosyl hydrolases family 6的一个未知蛋白,推测由于T-DNA插入阻断该蛋白活性,使突变体菌株表现出对水稻品种Pi-1（t）从无毒转变为有毒。此外,还通过交配培养实验以及分子水平检测,验证了3个突变体的交配型均为MAT1-1型,其中T940017403同KA9交配培养物潮霉素抗性比例验证为1:1,说明突变体的表型变化可能是单拷贝T-DNA插入引起的,为进一步的该相关毒性基因的克隆与分析奠定良好基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 综述
• 1.1 稻瘟病菌致病性研究进展
• 1.1.1 稻瘟病菌的致病性分化
• 1.1.2 稻瘟病菌无毒基因及其变异研究
• 1.1.2.1 稻瘟病菌无毒基因
• 1.1.2.2 无毒基因的应用前景
• 1.2 稻瘟病菌变异机制
• 1.2.1 物理诱变
• 1.2.2 化学诱变
• 1.2.3 无性重组
• 1.2.4 有性重组
• 1.2.5 质粒插入突变
• 1.2.6 突变
• 1.3 稻瘟病菌功能基因组研究
• 1.3.1 同源基因克隆及候选基因敲除法
• 1.3.2 图位克隆法
• 1.4 T-DNA插入在真菌功能基因组研究上的运用
• 2 材料与方法
• 2.1 供试菌株:
• 2.2 接种水稻:
• 2.3 培养基
• 2.4 抗生素
• 2.5 突变体致病性的测定
• 2.5.1 稻瘟病菌菌株的活化、扩大培养及产孢
• 2.5.2 育苗及活体接种
• 2.5.3 活体接种发病情况调查与记载
• 2.5.4 离体接种
• 2.5.4.1 离体用水稻苗培育
• 2.5.4.2 水稻叶片的离体接种
• 2.5.4.3 离体接种发病情况调查及记载
• 2.5.5 潮霉素抗性验证
• 2.6 突变体生长发育的观察
• 2.7 稻瘟病菌基因组DNA的提取及检测
• 2.7.1 DNA提取
• 2.7.2 DNA质量检测
• 2.8 基因组DNA琼脂糖电泳
• 2.9 稻瘟病菌RNA的提取
• 2.10 质粒的提取及检测
• 2.11 T-DNA插入分子检测
• 2.11.1 普通PCR（POLYMERASECHAINREACTION,PCR）检测方法
• 2.11.2 热不对称嵌套PCR（THERMAL ASYMMETRIC INTERLACED PCR TAIL-PCR）检测方法
• 2.11.3 HIGH-EFFICIENT THERMAL ASYMMETRIC INTERLACED PCR（HITAIL-PCR）
• 2.11.4 突变体基因组DNA的限制性酶切
• 2.11.5 酶切产物的连接
• 2.12 TAIL-PCR产物的克隆及测序
• 2.12.1 TAIL-PCR产物DNA片段的回收
• 2.12.2 回收的DNA片段连接
• 2.12.3 E.COLI DH5A感受态细胞的制备
• 2.12.4 感受态细胞的转化
• 2.12.5 质粒DNA的提取
• 2.13 DNA测序及蛋白序列分析
• 2.14 RT-PCR
• 2.15 突变体有性交配后代培养物潮霉素分离比例
• 3 结果与分析
• 3.1 致病性变异的T-DNA突变体筛选
• 3.2 潮霉素抗性验证
• 3.3 潮霉素基因片段扩增验证
• 3.4 致病性突变体表性分析
• 3.5 T-DNA插入侧翼序列分析
• 3.5.1 TAIL-PCR方法
• 3.5.2 HI TAIL-PCR方法
• 3.6 致病性突变体T-DNA侧翼序列的克隆与测序
• 3.7 RT-PCR验证T-DNA插入对基因影响
• 3.8 致病性突变体交配型的验证
• 3.8.1 有性交配子囊孢子培养物潮霉素抗性分离比例
• 4 结论与讨论
• 4.1 突变体致病性稳定分析
• 4.2 接种方式选择
• 4.3 快速筛选稻瘟病菌所需基因的突变体的途径
• 4.4 T-DNA侧翼序列的扩增
• 4.5 关于交配培养
• 4.6 有待进一步研究的问题
• 参考文献:
• 致谢: