重组人端粒酶逆转录酶基因表达载体的构建及检测端粒长度新方法初探

论文摘要

第一章人端粒酶催化亚基（hTERT）的研究现状和研究进展（文献综述）人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）基因是端粒酶的催化亚基,负责在染色体末端添加端粒重复序列,在维持细胞永生化中起重要作用。为探索过表达外源性hTERT基因转染对细胞生物学作用,本研究以人脐静脉血管内皮细胞（hUVEC）为研究对象,通过真核转染及病毒载体介导的基因转移技术促进hTERT基因在hUVEC细胞中过表达,观察其对hUVEC细胞增殖作用和端粒酶活性的影响。现综合近年来的文献,对人端粒酶催化亚基的研究现状作一简要综述。第二章过表达人端粒酶逆转录酶促进人脐静脉血管内皮细胞增殖目的:构建含人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的真核表达载体并转染人脐静脉血管内皮细胞（hUVEC）,探索转染后hTERT基因的表达及对细胞功能和生长的影响。方法:携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组质粒（pEGFP-C1-hTERT）是利用已有的PCI-neo-hTERT和pEGFP-C1质粒,通过酶切连接后,DNA测序验证了重组质粒pEGFP-C1-hTERT的准确性。将pEGFP-C1-hTERT真核表达载体通过脂质体2000转染到hUVEC中,通过RT-PCR、免疫组化、PCR-ELISA法和MTT检测细胞端粒酶基因表达和活性变化与细胞生长增殖情况。结果:所构建pEGFP-C1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。转染后细胞可见报告基因GFP的表达;MTT实验可见转染hTERT基因组72 h后细胞增殖速度快于未转染组及空载体组;RT-PCR、免疫组化及TRAP-PCR-ELISA法检测转染后的细胞,结果发现hTERT mRNA的表达、端粒酶活性均明显增强。结论:本研究成功构建了pEGFP-C1-hTERT真核表达载体并能够在真核细胞中表达,过表达的hTERT基因提高了血管内皮细胞端粒酶的活性和增殖能力,初步证实端粒酶活性与细胞增殖活性密切相关,为进一步构建永生化细胞系奠定基础。第三章构建携带重组人端粒酶逆转录酶第三代慢病毒载体及其病毒包装鉴定目的:构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的慢病毒表达载体及探索高滴度第三代慢病毒包装体系的建立,并观察hTERT基因调控表达。方法:用内切酶将hTERT基因从已有质粒PCI-neo-hTERT上切下,插入慢病毒载体pCDH-copGFP中构建慢病毒表达质粒pCDH-hTERT,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）片段的准确性后,将pCDH- hTERT、pCDH-PACK-GAG、pCDH-PACK-REV和VSV-G共转染包装细胞293T,浓缩上清并测定病毒滴度获得重组慢病毒,并进行PCR及293T中hTERT蛋白的表达鉴定重组慢病毒的包装。重组慢病毒再感染靶细胞hUVEC,通过检测标记蛋白-绿色荧光蛋白、hTERT蛋白表达和端粒酶活性进一步验证pCDH-hTERT在细胞中表达。结果:pCDH-hTERT携带正确hTERT基因,将其与包装质粒共转染293T细胞能产生重组病毒;病毒基因组PCR证实hTERT基因插入,感染后293T可检测到hTERT蛋白的表达;目的基因hTERT能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞并稳定表达,荧光显微镜下可直接观察GFP;RT-PCR法、Western blotting法及TRAP-PCR-ELISA法能检测感染后的细胞,结果发现hTERT mRNA的表达、hTERT蛋白的表达及端粒酶活性明显增强。结论:本研究成功构建了第三代慢病毒表达载体pCDH-hTERT,并获得高效的重组慢病毒,将外源hTERT基因转导入靶细胞重建端粒酶活性,为构建永生化细胞系奠定基础。第四章广西长寿物种端粒长度的检测与纳米金标记的巯基寡聚核苷酸探针快速灵敏检测端粒长度新方法的初探目的:应用Southern杂交技术对不同年龄段不同长寿物种端粒长度进行检测,从而了解Southern杂交对端粒长度检测的利弊,评估其是否适用于其他长寿物种的检测,探讨建立检测针对不同物种端粒长度新方法的必要性,并初步探索利用纳米金技术建立快速灵敏检测端粒长度新方法可行性。方法:选择广西常见的长寿物种草龟、眼镜蛇作为研究对象,应用Southern杂交技术进行检测不同年龄段不同长寿物种端粒长度,对检测端粒长度进行比较研究。以已知三种不同长度的端粒重复片段为标准品,初步探索将纳米金的共振散射效应和纳米金标记核酸探针结合起来建立一种测定端粒长度的新方法。通过制备粒径约10纳米的金纳米颗粒,用于标记针对人端粒重复序列的共振散射光谱探针5’-（CCCTAA）5（CH2）3SH-3’,对标记纳米金生物探针上寡核苷酸连接及与样品端粒杂交反应体系条件进行优化,探索利用纳米金技术建立快速灵敏检测端粒长度新方法的可行性。结果:所应用Southern杂交技术进行检测不同年龄段不同长寿物种端粒长度特异性及灵敏性均不高,各组间比较均无统计学意义。并成功完成标记纳米金生物探针上寡核苷酸的连接,通过优化了杂交反应体系中缓冲溶液的pH、AussDNA浓度、NaCl浓度、超声波辐照时间等四个主要反应条件的影响,杂交后信号波动较大,但仍未找到适合的杂交的反应条件,尚未能建立起稳定的纳米金探针检测端粒长度的新方法。结论:Southern杂交技术采用针对人端粒重复片段特定探针,不适合应用于其他长寿物种的检测,故需建立快速灵敏检测针对不同物种端粒长度新方法。新方法中标记好纳米金生物探针与样品端粒杂交反应体系是实验的一大难题,如何解决和建立纳米金生物探针与样品端粒杂交反应体系将是后续的实验的首要解决问题。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 人端粒酶催化亚基（hTERT）的研究现状和研究进展（文献综述）
• 1. 端粒与端粒酶
• 1.1 端粒的结构及其功能
• 1.2 端粒酶的结构及其功能
• 1.2.1 端粒酶RNA（hTR）
• 1.2.2 端粒酶相关蛋白（TP1、TP2、TRF1、TRF2）
• 1.2.3 端粒酶催化亚单位（hTERT）
• 2. 基于hTERT亚单位的端粒酶活性调控
• 3. 端粒、端粒酶与细胞衰老、长寿的关系
• 3.1 端粒酶依赖的端粒延长机制（TA型）
• 3.2 端粒替代延长机制（ALT 型）
• 4. 端粒酶催化亚基（hTERT）与细胞永生化
• 5. 永生化细胞在组织工程中的应用前景
• 6. 细胞基因转染的常用方法
• 7. 慢病毒及其优点
• 8. 端粒酶在卵巢肿瘤诊断和鉴别诊断中的作用
• 8.1 端粒酶活性与卵巢肿瘤组织良恶性的判断
• 8.2 端粒酶的活性与卵巢肿瘤的细胞分化和转移
• 8.3 端粒酶活性与卵巢肿瘤患者的预后
• 8.4 端粒酶各组分基因表达与临床病理的关系
• 9. 基于核酸适体纳米金探针催化的DNA杂交共振散射光谱检测
• 9.1 测定端粒重复片段长度方法现状研究
• 9.2 金纳米粒子的性质、制备、表征及分析应用
• 9.2.1 金纳米微粒的性质
• 9.2.2 金纳米微粒的制备
• 10. 共振散射技术的理论基础、特点、分析应用及发展前景
• 10.1 共振散射技术的理论基础
• 10.2 共振散射光谱法的特点
• 10.3 共振散射光谱法在核酸分析中的应用
• 11. DNA 杂交的研究进展
• 11.1 DNA 的化学结构
• 11.2 DNA 的碱基配对原则
• 11.3 DNA 的杂交
• 11.4 基于核酸适体纳米金探针催化的DNA 杂交
• 12. 本研究的目地和意义
• 参考文献
• 第二章 过表达人端粒酶逆转录酶促进人脐静脉血管内皮细胞增殖实验流程
• 实验流程
• 1. 材料及试剂
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒与菌株、细胞
• 1.1.2 实验主要仪器设备
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 部分试剂的配置
• 1.1.5 引物的设计
• 2. 方法
• 2.1 pEGFP-C1-hTERT 真核表达载体的构建
• 2.1.1 大肠杆菌感受态细菌的制备
• 2.1.2 pEGFP-C1 和pCI-neo-hTERT 质粒的样品准备
• 2.1.3 pEGFP-C1和pCI-neo-hTERT质粒的双酶切及酶切产物凝胶回收
• 2.1.3.1 pCI-neo-hTERT 质粒和载体pEGFP-C1 的双酶切反应体系
• 2.1.3.2 酶切完全后电泳充分分离
• 2.1.3.3 酶切产物的纯化与回收
• 2.1.4 回收的PCR产物与pEGFP-C1载体连接
• 2.1.5 连接产物转化至感受态DH-5α
• 2.1.6 挑选阳性克隆扩大培养
• 2.1.7 质粒DNA的快速提取（碱裂解法）
• 2.1.8 检测连接是否成功
• 2.1.8.1 双酶切鉴定
• 2.1.8.2 测序
• 2.1.9 测序结果序列分析
• 2.2 脂质体法转染hUVEC细胞
• 2.2.1 hUVEC 的培养和转染前的处理
• 2.2.2 hTERT 基因转染内皮细胞
• 2.2.3 RT-PCR法检测转染后hTERT基因表达
• 2.2.3.1 转染hUVEC总RNA提取
• 2.2.3.2 总RNA的定量及纯度测定
• 2.2.3.3 cDNA合成
• 2.2.3.4 RT-PCR测定hTERT mRNA的表达
• 2.2.4 转染重组质粒细胞端粒酶活性检测
• 2.2.5 免疫组织化学法检测转染后hTERT 表达
• 2.2.6 MTT法检测细胞生长增值情况
• 3. 结果
• 3.1 pEGFP-C1-hTERT 重组质粒的质粒的鉴定
• 3.2 转染pEGFP-C1-hTERT质粒后hUVEC荧光表达
• 3.3 pEGFP-C1-hTERT 重组质粒转染hUVEC 细胞后hTERT mRNA 的表达
• 3.4 转染hTERT基因细胞端粒酶蛋白的表达情况
• 3.5 端粒酶活性检测
• 3.6 hTERT 基因对内皮细胞的生长增殖的影响
• 4、讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三章 构建携带重组人端粒酶逆转录酶第三代慢病毒载体及其病毒包装鉴定
• 实验流程
• 1. 材料及试剂
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒与细胞
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要试剂的配置
• 1.1.4 实验主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 pCDH- hTERT 慢病毒表达载体的构建
• 1.2.1.1 双酶切pCI-neo-hTERT和pCDH-copGFP质粒
• 1.2.1.2 酶切产物的纯化和回收
• 1.2.1.3 插入片段hTERT与pCDH- copGFP线性质粒的连接
• 1.2.1.4 连接产物转化DH5a 感受态
• 1.2.1.5 挑取氨苄抗性阳性单克隆菌落，提取质粒进行鉴定
• 1.2.1.6 pCDH-hTERT的双酶切鉴定及测序分析
• 1.2.2 携带hTERT基因重组慢病毒的包装与浓缩
• 1.2.2.1 293T细胞的复苏及传代培养
• 1.2.2.2 慢病毒包装
• 1.2.2.3 含hTERT-GFP慢病毒颗粒上清液的收集及浓缩
• 1.2.2.4 鉴定重组慢病毒的包装是否成功
• 1.2.2.5 慢病毒的滴度测定
• 1.2.2.6 重组慢病毒感染不同的细胞
• 1.2.2.7 重组慢病毒pCDH- hTERT在靶细胞中的表达
• 1.2.2.7.1 细胞分组方案
• 1.2.2.7.2 RT-PCR检测转导重组慢病毒前后靶细胞端粒酶基因hTERT mRNA 的表达情况
• 1.2.2.7.3 重组慢病毒感染293T及hUVEC后Western blotting检测hTERT蛋白的表达
• 1.2.2.7.4 重组慢病毒感染靶细胞后端粒酶的活性检测
• 1.2.2.8 统计学处理
• 2. 结果
• 2.1 重组质粒pCDH- hTERT的鉴定
• 2.2 包装细胞293T细胞转导pCDH-hTERT质粒后GFP的表达
• 2.3 携带重组慢病毒的包装和病毒滴度的测定
• 2.4 重组慢病毒介导hTERT基因感染不同的四种细胞后GFP的表达与感染效率
• 2.5 重组慢病毒转导前后细胞端粒酶基因hTERT mRNA的表达
• 2.6 Western blotting 检测感染hUVEC 细胞后hTERT 蛋白的表达
• 2.7 端粒酶活性检测
• 3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第四章 广西长寿物种端粒长度的检测与纳米金标记的巯基寡聚核苷酸探针快速灵敏检测端粒长度新方法的初探
• 实验流程
• 1. 材料及方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 研究对象及分组
• 1.1.2 不同长度端粒重复靶片段
• 1.1.3 实验主要仪器设备
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 主要试剂的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 DNA提取
• 1.2.2 DNA 浓度及纯度测定
• 1.2.3 Southern杂交
• 1.2.4 纳米金的制备
• 1.2.5 金标记端粒探针（Au-SH-ssDNA）的制备
• 1.2.5.1 端粒探针（SH-ssDNA）用量确定
• 1.2.5.2 金标记端粒探针的制备
• 1.2.5.3 金标记端粒探针与端粒标准品杂交反应
• 2. 结果
• 2.1 DNA 提取质量（浓度及纯度）测定
• 2.2 Southern 杂交检测不同物种端粒长度
• 2.3 制备的胶体金的质量鉴定
• 2.4 金标记端粒探针的用量确定
• 2.5 实验条件的优化
• 2.5.1 杂交反应条件的优化
• 2.5.1.1 缓冲溶液的pH 影响
• 2.5.1.2 Au-SH-ssDNA 浓度的影响
• 2.5.1.3 NaCl 浓度的影响
• 2.5.1.4 超声波辐照时间的影响
• 2.5.1.5 改变杂交条件,配制不同的杂交液进行反应
• 3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 致谢
• 攻读学位期间参与的课题及发表的学术论文