鲨鱼软骨硫酸角质素的制备及其壳聚糖纳米粒抗类风湿性关节炎作用的研究

鲨鱼软骨硫酸角质素的制备及其壳聚糖纳米粒抗类风湿性关节炎作用的研究

论文摘要

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的以慢性多关节炎症为主要表现的全身性自身免疫性疾病。通过对RA的发病机制研究,抗炎治疗已经成为RA治疗的一个重要原则。近年来,糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)类药物的抗炎作用研究已有报道,本课题选择了鲨鱼软骨中的硫酸角质素进行抗炎作用研究。硫酸角质素(keratan sulfate,KS)属于糖胺聚糖类化合物,以半乳糖与6-硫酸-N-乙酰氨基葡萄糖通过β1→4糖苷键组成的二糖单位为主要重复双糖单位,双糖之间通过β1→3糖苷键连接形成线形分子,它是鲨鱼软骨多糖成分中唯一不含糖醛酸的糖胺聚糖,来源于鲨鱼软骨的KS与其他来源的KS相比,结构上的差别主要在于其含有更多的硫酸根取代基。最近研究表明,KS寡糖级分可作为抗炎剂、抗过敏剂、免疫调节剂等,KS二糖片段Gal-6-SO3-(β1,4)-GlcNAc-6-SO3能通过抑制磷酸蛋白激酶C及磷酸肌醇-3激酶通路,从而抑制IL-12的分泌从而起到抗炎用。本课题研究了来源于鲨鱼软骨的KS的制备,结构解析,壳聚糖纳米粒的制备及其对RA大鼠的治疗作用,探讨了KS对大鼠RA炎症过程中血清中IL-Iβ和TNF-α含量的影响。1鲨鱼软骨多糖的分离和纯化将精制的鲨鱼软骨多糖提取物经Q SepharoseTMFast Flow强离子交换柱层析进行分离,Sephadex G-10凝胶柱层析脱盐后,获得组成相对单一的组分,通过糖醛酸反应鉴定出KS,并对其进行了分子量、氨基己糖含量、硫酸根含量等理化性质及结构特点研究。2 KS的结构分析利用红外光谱(IR)、核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR)结果分析确定KS的主要分子结构。红外光谱结果显示,KS结构中含有羟基、羰基和酰胺基结构,并含有硫酸基,其结构中不含有糖醛酸,进一步说明其为KS。核磁共振结果显示,KS多糖分子中除含有Gal及GlcNAc单糖残基外,还含有NeuAc残基。3 KS-CTS纳米粒的制备设计正交试验,通过考察纳米粒粒径及Zeta电位值,分析了壳聚糖(chitosan,CTS)分子量,KS、CTS溶液体积比等因素对纳米粒制备的影响。确定最佳实验条件:CTS分子量为5kD,KS、CTS体积比为1:4,pH值为6,KS浓度为1mg/mL,CTS浓度为2 mg/mL,液体混合滴加速度为3s一滴。纳米粒制备中,为减小大鼠灌胃量,在45℃下旋蒸纳米粒溶液使体积缩减一半。4 KS对大鼠类风湿性关节炎的治疗作用建立大鼠RA模型,对大鼠体重、足跖肿胀度、X线分析及病理切片确定各组大鼠炎症情况。结果显示,KS能够减轻炎症反应、降低大鼠足跖肿胀度。研究了KS对RA大鼠血清中细胞因子Rat TNF-α、Rat IL-1β的影响,结果显示,模型组大鼠血清中细胞因子Rat TNF-α含量为14.47±4.832 pg/mL,明显高于阴性对照组(4.375±2.611 pg/mL)、阳性对照组(5.217±2.589 pg/mL)和样品组(7.086±3.201 pg/mL)(P<0.05);模型组大鼠血清中细胞因子Rat IL-1β含量为39.5±17.735 pg/mL,明显高于阴性对照组(7.330±2.733 pg/mL)、阳性对照组(9.038±5.310 pg╱mL)、样品组(15.462±7.281 pg/mL)(P<0.05)。本研究取得的主要成果有:(1)将KS分离纯化后,首次将KS制备成壳聚糖纳米粒,并进行了制备工艺研究。(2)研究了KS对大鼠RA模型的治疗作用。结果显示,KS能够抑制大鼠血清中Rat TNF-α、Rat IL-1β的含量,从而在一定程度上对大鼠佐剂性关节炎的关键步骤起到一定的抑制作用。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号说明
  • 第一章 前言
  • 1 类风湿性关节炎发病机制
  • 1.1 RA发病机制的自身免疫反应过程
  • 1.2 细胞因子网络与RA的关系
  • 1.3 NF-κB与RA的关系
  • 2 SCP与RA
  • 3 KS-CTS纳米粒给药剂型
  • 4 KS在抗炎方面研究现状
  • 5 本课题拟解决的关键问题
  • 第二章 KS的制备与理化性质测定
  • 1 材料
  • 1.1 试剂
  • 1.2 仪器
  • 2 方法
  • 2.1 SCP纯度测定
  • 2.2 SCP的分离、纯化
  • 2.3 KS组分的确定
  • 2.4 KS分子量测定
  • 2.5 有机硫酸根含量测定
  • 2.6 氨基己糖含量测定
  • 3 实验结果
  • 3.1 SCP紫外扫描图谱
  • 3.2 SCP的分离、纯化
  • 3.3 咔唑法测定糖醛酸含量
  • 3.4 KS分子量测定结果
  • 3.5 有机硫酸根含量测定结果
  • 3.6 氨基己糖含量测定结果
  • 4 讨论
  • 5 小结
  • 第三章 KS的结构研究
  • 1 材料
  • 1.1 试剂
  • 1.2 仪器
  • 2 方法
  • 2.1 紫外光谱扫描
  • 2.2 红外光谱扫描
  • 2.3 核磁共振图谱测定
  • 3 结果
  • 3.1 KS的紫外扫描图谱及结果分析
  • 3.2 KS的红外光谱扫描及结果分析
  • 3.3 KS核磁共振图谱扫描及结果分析
  • 4 讨论
  • 5 小结
  • 第四章 KS-CTS纳米粒的制备
  • 1 材料
  • 1.1 试剂
  • 1.2 仪器
  • 2 方法
  • 2.1 KS-CTS纳米粒的制备
  • 2.2 KS-CTS纳米粒的理化性质测定
  • 2.3 制备工艺对纳米粒粒径和zeta电位值的影响
  • 3 试验结果
  • 3.1 壳聚糖纳米粒形态及zeta电位值的测定结果
  • 3.2 制备工艺对纳米粒粒径和zeta电位值的影响
  • 4 讨论
  • 5 小结
  • 第五章 KS-CTS纳米粒对类风湿性关节炎药效学研究
  • 1 材料
  • 1.1 试剂
  • 1.2 仪器
  • 2 方法
  • 2.1 大鼠类风湿性关节炎模型的建立
  • 2.2 KS-SCP对大鼠体重、足跖肿胀度和外观的影响
  • 2.3 大鼠膝关节组织形态学改变
  • 2.4 病理切片的制备及观察
  • 2.5 血清中细胞因子的测定
  • 3 统计学方法
  • 4 结果
  • 4.1 KS-SCP对大鼠体重、足跖肿胀度及外观的影响
  • 4.2 大鼠膝关节组织形态学改变
  • 4.3 大鼠血液中Rat TNF-α的变化
  • 4.4 大鼠血清中Rat IL-1β的变化
  • 5 讨论
  • 6 小结
  • 附录
  • 参考文献
  • 总结
  • 致谢
  • 硕士学位期间发表的学术论文
  • 学位论文评阅及答辩情况表
  • 相关论文文献

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