兔GDF9的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究

论文摘要

根据NCBI上已发表的小鼠、人GDF9mRNA序列,分别在第1外显子和第2外显子处设计两对引物。采集母兔卵巢组织,利用Trizol法提取总RNA,然后用RT-PCR法进行cDNA扩增,获得了长度为289bp和299bp的两段目的片段。运用TA克隆法,将目的片段连接到PMD19-T载体上,通过蓝白斑筛选和菌液PCR对重组质粒进行鉴定。测序后进行比对发现,目的片度长度为289bp的序列与人、猪的、牛的、小鼠的GDF9相对应序列,同源性分别为81%、78%、77%、74%。目的片段长度为299bp的序列与猪、人、牛、小鼠、山羊GDF9相对应序列同源性分别为86%、86%、86%、82%、87%。用免疫组织化学方法对兔卵巢和睾丸中的GDF9蛋白进行定位,结果显示,原始卵泡中未见阳性表达,在初级卵泡中开始出现阳性表达,棕黄色阳性产物主要存在于卵母细胞膜上;次级卵泡中阳性表达增加,主要集中于卵母细胞胞质;在有腔卵泡中阳性表达位于卵母细胞膜和卵丘颗粒细胞,与次级卵泡相比表达有所下降。黄体中出现阳性表达。兔睾丸中GDF9蛋白呈阳性表达,棕黄色阳性表达产物主要存在于初级精母细胞和圆形精子细胞。精原细胞、支持细胞及成熟精子中呈阴性表达。采集公兔的下丘脑、垂体、睾丸、附睾和母兔的下丘脑、垂体、卵巢、子宫组织,利用Trizol法提取总RNA。RT-PCR法对其进行组织表达谱研究,发现在上述组织中都有GDF9mRNA的表达,表明GDF9mRNA的表达在兔上不具有特异性。利用实时荧光定量PCR法测定公兔的下丘脑、垂体、睾丸、附睾和母兔的下丘脑、垂体、卵巢、子宫中GDF9mRNA相对表达丰度变化。结果表明:在公兔的下丘脑-垂体-腺轴中,以公兔睾丸为校正样本表达量为1,下丘脑、垂体中的GDF9mRNA表达量分别是它的0.1354倍、0.4394倍,附睾中GDF9mRNA的表达量明显高于上述三种组织为睾丸的3.0543倍。在母兔的下丘脑-垂体-性腺轴中,以母兔垂体为校正样本表达量为1,卵巢表达量最多,为垂体的13.7271倍,下丘脑中的表达量为垂体的5.035倍,子宫表达量低于下丘脑为垂体的2.0528倍。各组织间GDF9mRNA表达水平差异显著。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1.GDF9 的研究进展
• 2.研究的目的和意义
• 1.实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 质粒、菌株
• 1.3 药品及试剂盒
• 1.4 主要仪器
• 1.5 溶液配制及培养基
• 2. 实验方法
• 2.1 GDF9 基因部分cDNA 的克隆与序列分析
• 2.1.1 器皿的处理
• 2.1.2 样品的采集
• 2.1.3 总RNA 的提取
• 2.1.4 总RNA 的DNAse 处理
• 2.1.5 RT-PCR
• 2.1.6 PCR 产物的克隆及鉴定
• 2.1.7 核酸序列测定与分析
• 2.2 GDF9m RNA 组织表达谱
• 2.3 GDF9 蛋白在兔性腺中的定位
• 2.4 GDF9 m RNA 表达实时荧光定量检测
• 3. 结果与分析
• 3.1 GDF9 cDNA 的克隆与序列分析
• 3.2 GDF9 mRNA 的组织表达谱
• 3.3 GDF9 蛋白在兔性腺中的定位与分析
• 3.4 GDF9mRNA 表达实时荧光定量检测
• 4. 讨论
• 4.1 GDF9 序列的同源性分析
• 4.2 GDF9 蛋白在卵巢中的定位
• 4.3 GDF9 蛋白在睾丸中的定位
• 4.4 各组织 GDF9mRNA 表达表达分析
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文