采油微生物筛选、鼠李糖脂产脂性能及关键酶基因克隆与表达研究

论文摘要

世界范围内原油贮量的日益减少带来了严重的能源危机,而以常规技术,一般只能开采出30%的原油,大量石油尤其是高粘油滞留在储油层。微生物提高原油采收率（MEOR）是目前公认的开采油藏中剩余油和枯竭油藏最好的技术,对充分利用现有油矿藏资源,意义重大。另外,在石油的勘探与开采,运输与储存,炼制与使用过程中,常会造成石油外泄或不当排放,对环境造成严重的污染。应用烃降解微生物对污染地区进行生物修复因其具有适用范围广、操作简单、效果显著、费用低、无二次污染等优点而被认为是解决复杂烃类污染的最彻底最有效的手段。铜绿假单胞菌所产生的鼠李糖脂生物表面活性剂具有良好的表/界面活性和乳化活性,能形成胶束溶液,乳化分散烃类物质,降低原油粘度;对烃类的增溶作用能促进微生物对烃类的摄取,从而提高微生物对烃类的降解效率;此外,作为生物表面活性剂又具有无毒、可生物降解的优点。这都使其成为在MEOR和石油污染的生物修复领域中最佳的生物表面活性剂。不同来源的铜绿假单胞菌其鼠李糖脂的组成,性能,产量差距均较大,寻找合适石油工业的产脂菌株及其复配菌株具有重要价值。另外,铜绿假单胞菌虽然可高效产脂,但它是人体条件致病菌,不适合大规模工业应用。而利用基因工程的方法,将鼠李糖脂合成途径中的关键酶——鼠李糖基转移酶转入其它无害采油微生物受体中,构建产鼠李糖脂的工程采油微生物直接应用于生产可以有效避免菌株毒性。关于鼠李糖基转移酶基因在采油菌中的表达研究,少见国内外报道。在此方面的研究可为基因工程菌在微生物采油和石油烃污染的生物修复中的应用提供理论基础。本文主要从上述两点展开进行研究工作,主要研究内容和结果如下:1.产鼠李糖脂的原油降解菌的筛选与鉴定以原油为唯一碳源和能源,从油田样品中分离筛选多株兼性厌氧原油烃类降解菌,通过表面张力测量从中筛选出产糖脂生物表面活性剂的原油降解菌SH6。通过形态学观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析鉴定其为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。该菌生长于原油培养基中,能很好的乳化分散原油,并将原油发酵液的表面张力降至37.4 mN/m。经GC-MS分析,P.aeruginosa SH6可以利用C13～C28较宽范围的原油烃组分,其原油降解率为18.8%,原油粘度降低率为47.7%。利用TLC、IR及蓝平板法分析,证明其产生的生物表面活性代谢产物为鼠李糖脂。2.鼠李糖脂理化性质和乳化活性的研究制备P.aeruginosa SH6所产的鼠李糖脂粗提样品。利用HPLC-MS分离鉴定了其所产鼠李糖脂同系物中的组分。结果表明,以甘油为唯一碳源时,P.aeruginosa SH6所产鼠李糖脂中主要包含8种同系物,都由1～2分子鼠李糖和1～2个C8～C12碳链长度的β-羟基饱合或不饱合脂肪酸组成。该鼠李糖脂粗品CMC为166.7 mg/L,在CMC时的表面张力为29.5 mM/m。该糖脂表现极高温度（-20～120℃）和盐度耐受性（小于50%NaCl,20%MgCl2和CaCl2）及优良的环境稳定性,并可在一定的pH范围内（1～7）保持活性。对液体石蜡、甲苯、植物油和原油等疏水性有机物具有良好的乳化性能。这些性质使得其在石油工业和石油污染修复领域具有良好的应用前景。3.碳氮源对鼠李糖脂生产的影响就不同种类的碳源和氮源对P.aeruginosa SH6产脂的影响进行了研究。结果表明,P.aeruginosa SH6可以利用多种类型的碳氮源产脂。其中以葡萄糖与菜籽油（1:1）为复合碳源,酵母粉与硝酸钠为复合氮源,且碳氮比为18:1时产脂量最高,达5.40 g/L。保持此最优碳氮比加大碳氮源浓度时,在碳源浓度为7%时产脂量最高,达6.37 g/L。这些研究为进一步的鼠李糖脂发酵生产条件的优化和应用不同碳氮源时所产鼠李糖脂组分与理化性质的研究提供了依据和基础。4.鼠李糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达研究对P.aeruginosa SH6的鼠李糖基转移酶结构基因rhlAB和rhlABRI操纵子进行克隆与鉴定。构建含鼠李糖基转移酶rhlAB和rhlABRI的重组质粒pSAOR2和pJDOR4,利用鼠李糖基转移酶自身启动子使其在大肠杆菌E.coli SM10、E.coliDH5α中进行表达。结果表明,只转入结构基因rhlAB的两种大肠杆菌产脂量均很低;而转入rhlABRI操纵子的两宿主产脂量均有所提高,其中E.coli DH5α产脂量最高达105.2 mg/L。仅管是应用自身启动子而不是强启动子进行表达,这一产量在重组大肠杆菌表达鼠李糖脂的研究中仍是较高的,并且可以避免使用IPTG带来的成本问题和操作上的麻烦。对鼠李糖基转移酶基因进行克隆及在大肠杆菌中表达,为该基因在采油菌中的表达研究提供基础。5.鼠李糖基转移酶基因在采油微生物中的表达研究构建了采油微生物接合转移系统,利用该系统成功地将含鼠李糖基转移酶rhlAB和rhlABRI的重组质粒pSAOR2和pJDOR4转移进入采油微生物受体菌中并进行了验证。鼠李糖基转移酶基因在采油微生物中的表达情况与其在大肠杆菌中的表达情况基本一致。只转入结构基因rhlAB的两种采油菌产脂量极低;而转入rhlABRI操纵子的两宿主产脂量均有不同程度提高,其中Pseudomonas sp.JH4（pJDOR4）产脂量最高为101.8mg/L。这一表达量虽然没达到期望的高效表达的水平,但还有进一步研究的空间,并且也为采油基因工程菌在微生物采油和石油烃污染的生物修复中应用的可行性研究提供了理论依据和实验基础信息。6.其它优良MEOR菌株的研究在采油微生物的分离筛选过程中得到一株新的降蜡菌LH3,经鉴定为友谊戈登氏菌。该菌株在好氧和厌氧条件下均能利用C18～C36的烃组分生长从而降解石蜡,好氧时降蜡率约达18.0%,厌氧时降蜡率仅为好氧条件下的1/8。该菌最适生长温度为37～40℃;在5%盐浓度下能很好地生长,对10%高盐浓度有一定的耐受能力;0.2%鼠李糖脂表面活性剂可以明显促进其生长和提高降蜡率。此外,该菌能够降解石油,降油率达到10.4%,降粘率达到44.7%。这些结果显示,G.amicalis LH3作为微生物清防蜡菌剂有较好的应用前景,在原油污染的生物修复和MEOR助采方面也具有很好的应用潜力。此外,后续的研究中可将其作为鼠李糖脂复配菌株或采油工程菌的受体菌株进行深入的研究。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 符号说明及缩写词
• 第一章 研究背景综述
• 1.1 微生物提高石油采收率
• 1.1.1 石油的形成及组分
• 1.1.2 MEOR技术的发展过程及其优势
• 1.1.3 MEOR的作用机理和微生物学方法
• 1.1.4 MEOR菌株的特点及来源
• 1.2 微生物对石油烃类污染的生物修复
• 1.2.1 烃类污染给自然界带来的危害
• 1.2.2 微生物降解石油烃的机理
• 1.2.3 烃类污染物生物修复的技术方法
• 1.2.4 与石油烃降解有关的微生物
• 1.3 鼠李糖脂生物表面活性剂及其在石油工业中的应用
• 1.3.1 生物表面活性剂
• 1.3.1.1 生物表面活性剂的优点
• 1.3.1.2 生物表面活性剂的种类及微生物菌种来源
• 1.3.1.3 生物表面活性剂的应用
• 1.3.2 鼠李糖脂生物表面活性剂
• 1.3.2.1 鼠李糖脂的化学结构
• 1.3.2.2 鼠李糖脂的生物合成
• 1.3.2.3 鼠李糖脂的生产
• 1.3.2.4 鼠李糖脂的生理功能及其在石油工业中的应用
• 1.4 本论文研究的目的和意义
• 第二章 产鼠李糖脂生物表面活性剂的兼性厌氧原油降解茵的筛选与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 主要仪器与试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 实验方法
• 2.1.4.1 兼性厌氧原油降解菌株的分离筛选
• 2.1.4.1.1 厌氧操作方法
• 2.1.4.1.2 初筛
• 2.1.4.1.3 复筛
• 2.1.4.2 菌种鉴定
• 2.1.4.2.1 培养特征与个体形态
• 2.1.4.2.2 生理生化实验
• 2.1.4.2.3 16S rDNA序列分析
• 2.1.4.3 菌株MEOR性能研究
• 2.1.4.3.1 原油降解
• 2.1.4.3.2 原油降粘
• 2.1.4.3.3 菌株作用后原油烃组分分析
• 2.1.4.4 菌株生物表面活性代谢产物的鉴定
• 2.1.4.4.1 TLC法糖脂定性分析
• 2.1.4.4.2 TLC法糖定性分析
• 2.1.4.4.3 Blue agar plates法定性鼠李糖脂
• 2.1.4.4.4 红外光谱分析
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 兼性厌氧MEOR菌株的分离筛选
• 2.2.2 菌株SH6的鉴定
• 2.2.3 P.aeruginosa SH6性能研究
• 2.3.3.1 P.aeruginosa SH6在葡萄糖培养基和LB培养基中的生长
• 2.3.3.2 P.aeruginosa SH6在原油中的生长曲线及原油降解和降粘能力
• 2.3.3.3 P.aeruginosa SH6的对原油饱合烃组分的利用
• 2.2.4 P.aeruginosa SH6鼠李糖脂生物表面活性代谢产物的鉴定
• 2.3 本章小结
• 第三章 铜绿假单胞菌SH6鼠李糖脂理化性质及碳氮源对其产脂的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要仪器与试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 实验方法
• 3.1.4.1 鼠李糖脂代谢产物粗提样品理化性质的研究
• 3.1.4.1.1 粗品糖脂的制备
• 3.1.4.1.2 粗提糖脂样品的HPLC-MS分析
• 3.1.4.1.3 临界胶束浓度（CMC）的测定
• 3.1.4.1.4 鼠李糖脂稳定性研究
• 3.1.4.1.5 鼠李糖脂粗提样品乳化性能研究
• 3.1.4.2 碳氮源对P.aeruginosa SH6鼠李糖脂生产的影响
• 3.1.4.2.1 培养方法
• 3.1.4.2.2 菌体浓度测定
• 3.1.4.2.3 鼠李糖脂含量的测定
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 P.aeruginosa SH6鼠李糖脂代谢产物的理化性质研究
• 3.2.1.1 鼠李糖脂粗提样品的制备
• 3.2.1.2 鼠李糖脂粗提样品组分分析
• 3.2.1.3 P.aeruginosa SH6鼠李糖脂代谢产物粗提样品的理化性质的研究
• 3.2.1.3.1 临界胶束浓度（critical micelle concentration,CMC）的测定
• 3.2.1.3.2 鼠李糖脂对温度的稳定性
• 3.2.1.3.3 鼠李糖脂对盐度的稳定性
• 3.2.1.3.4 鼠李糖脂对酸碱的稳定性
• 3.2.1.3.5 鼠李糖脂时间稳定性研究
• 3.2.1.3.6 鼠李糖脂乳化性能研究
• 3.2.2 碳、氮源对P.aeruginosa SH6鼠李糖脂产量的影响
• 3.2.2.1 碳源的影响
• 3.2.2.1.1 以甘油为碳源时鼠李糖脂发酵生产动态
• 3.2.2.1.2 以葡萄糖为碳源时鼠李糖脂发酵生产动态
• 3.2.2.1.3 多种单一碳源和复合碳源对鼠李糖脂产生的影响
• 3.2.2.1.4 复合碳源中葡萄糖添加量对鼠李糖脂产生的影响
• 3.2.2.2 氮源及碳氮比的影响
• 3.2.2.3 碳氮源浓度的影响
• 3.3 本章小结
• 第四章 鼠李糖基转移酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 细菌菌株和质粒
• 4.1.2 主要仪器与试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 实验方法
• 4.1.4.1 基因供体菌染色体提取
• 4.1.4.2 质粒DNA的提取
• 4.1.4.3 目的基因的PCR扩增
• 4.1.4.3.1 rhlAB的扩增
• 4.1.4.3.2 rhlABRI的扩增
• 4.1.4.4 重组质粒的构建
• 4.1.4.4.1 目的基因与载体的限制性内切酶消化反应
• 4.1.4.4.2 线状载体DNA的去磷酸化
• 4.1.4.4.3 目的基因与载体的连接
• 4.1.4.4.4 感受态细胞的制备
• 4.1.4.4.5 热激法转化
• 4.1.4.4.6 转化子的验证
• 4.1.4.5 鼠李糖基转移酶基因在大肠杆菌中的表达研究
• 4.2 结果
• 4.2.1 鼠李糖基转移酶基因rhlAB及rhlABRI的克隆与鉴定
• 4.2.1.1 P.aeruginosa SH6染色体的提取
• 4.2.1.2 鼠李糖基转移酶基因rhlAB及rhlABRI的扩增、克隆与鉴定
• 4.2.1.2.1 引物设计
• 4.2.1.2.2 鼠李糖基转移酶基因rhlAB及rhlABRI的克隆与鉴定
• 4.2.2 含rhlAB的重组质粒pSAOR2的构建及E.coli的转化
• 4.2.2.1 重组质粒pSAOR2的构建及转化E.coli DH5α
• 4.2.2.2 重组质粒pSAOR2转化E.coli SM10
• 4.2.3 含rhlABRI的重组质粒pJDOR4的构建及E.coli的转化
• 4.2.3.1 重组质粒pJDOR4的构建及转化E.coli DH5α
• 4.2.3.2 重组质粒pJDOR4转化E.coli SM10
• 4.2.4 鼠李糖基转移酶基因在大肠杆菌中的表达研究
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 第五章 鼠李糖基转移酶基因在采油微生物中的表达研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 主要仪器与试剂
• 5.1.3 培养基
• 5.1.4 实验方法
• 5.1.4.1 受体菌的选择与菌种鉴定
• 5.1.4.2 接合转移
• 5.1.4.2.1 供体菌和受体菌的准备
• 5.1.4.2.2 接合转移
• 5.1.4.2.3 接合子的筛选
• 5.1.4.3 电转化
• 5.1.4.3.1 感受态细胞的制备
• 5.1.4.3.2 电转化
• 5.1.4.4 接合子和转化子的筛选与鉴定
• 5.1.4.4.1 重组质粒的提取
• 5.1.4.4.2 重组质粒酶切验证
• 5.1.4.4.3 PCR方法鉴定
• 5.1.4.4.4 菌体PCR鉴定
• 5.1.4.5 鼠李糖基转移酶基因在采油微生物中的表达研究
• 5.2 结果
• 5.2.1 受体菌选择
• 5.2.2 鼠李糖基转移酶结构基因rhlAB在采油微生物中的表达研究
• 5.2.2.1 鼠李糖基转移酶结构基因rhlAB转入采油微生物
• 5.2.2.2 鼠李糖基转移酶结构基因rhlAB在采油微生物中的表达
• 5.2.3 鼠李糖基转移酶rhlABRI操纵子在采油微生物中的表达研究
• 5.2.3.1 鼠李糖基转移酶rhlABRI操纵子转入采油微生物
• 5.2.3.2 鼠李糖基转移酶rhlABRI操纵子在采油微生物中的表达
• 5.3 讨论
• 5.4 本章小结
• 第六章 石蜡降解菌株的筛选、鉴定及降蜡性能的研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 样品来源与使用菌株
• 6.1.2 主要仪器与试剂
• 6.1.3 培养基
• 6.1.4 实验方法
• 6.1.4.1 兼性厌氧石蜡降解菌株的分离筛选
• 6.1.4.2 菌种鉴定
• 6.1.4.3 菌株性能研究
• 6.1.4.3.1 种子的准备及培养条件
• 6.1.4.3.2 菌体生长测定
• 6.1.4.3.3 降蜡率的测定
• 6.1.4.3.4 菌株作用前后石蜡组分分析
• 6.1.4.3.5 原油降解
• 6.1.4.3.6 原油降粘
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 兼性厌氧降蜡菌株的分离筛选及性能初步研究
• 6.2.2 菌种鉴定
• 6.2.3 G.amicalis LH3降蜡性能的研究
• 6.2.3.1 好氧和厌氧条件下LH3的生长和对石蜡的利用
• 6.2.3.2 盐度对生长及降蜡的影响
• 6.2.3.3 温度对生长及降蜡情况的影响
• 6.2.3.4 鼠李糖脂生物表面活性剂对生长及降蜡的影响
• 6.2.3.5 G.amicalis LH3与其它MEOR菌株降蜡降油降粘效果比较
• 6.3 本章节小结
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 致谢
• 附录
• 学位论文评阅及答辩情况表