伏马毒素免疫检测及免疫亲和柱纯化的研究

论文摘要

论文试验中使用戊二醛一步法将伏马毒素与KLH连接,制备伏马毒素的免疫原。用此连接制得免疫原免疫兔子,得到了两种特异性多克隆抗体。分别考察这两种抗体的亲和力,选择特异性较好的1号抗体进行酶联免疫分析和免疫亲和柱的研究。对酶联免疫分析中多项条件的优化,认为该试验的最佳包被量为1μg/孔,最佳酶标用量为1:12000,在pH值为7.5时,使用1倍PBS作为稀释液可以得到最佳检测效果,该酶联免疫吸附检测的最低检测限IC15为0.18±0.08μg/kg。分别选择玉米、大麦、小麦和燕麦为试剂样品检测的对象,采用稀释与添加掩蔽剂结合的方法,针对不同的样品,分别采取不同的方式有效地消除了基质对ELISA分析结果的影响。随后,分别对上述样品进行了伏马毒素的添加回收试验,结果表明四种谷物的回收率皆在65%-95%之间。为实际应用酶联免疫试剂盒的推出,进行了抗体冻干稳定性试验和酶标抗原以及抗体的稳定性试验,分析结果认为可保证试剂盒在4℃条件下放置6个月仍保持检测性能基本不变。在完成酶联免疫分析研究并且具备充足抗体的基础上,本论文进行了伏马毒素免疫亲和柱的研究。将伏马毒素多克隆抗体与sepharose-4B偶联,制备了对伏马毒素有特异性吸附的免疫亲和柱。经过测定偶联率进行了洗脱剂、洗脱时间、洗涤剂、ELISA掩蔽剂等方面的研究,并最终以玉米为例,使用免疫亲和柱理想的消除了基质影响。进行低浓度的添加回收试验,回收率为52%-63%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1.前言
• 1.1 伏马毒素简介
• 1.2 伏马毒素毒性作用
• 1.2.1 马脑白质软化症（Equine Leucoencephalomalacia,ELEM）
• 1.2.2 人类食道癌（Human Esophageal Cancer,HEC）
• 1.2.3 猪肺水肿（Pig Pulmonary Edema,PPE）
• 1.2.4 大鼠肝中毒及肝癌（Rat Liver Cancer）
• 1.2.5 对鸡胚有致病性或致死性作用并且抑制鸡免疫系统的生理功能
• 1.3 伏马毒素毒性作用机理
• 1.4 伏马毒素的污染状况
• 1.5 伏马毒素的国际标准
• 1.6 伏马毒素的检测方法
• 1.7 酶免疫分析法（EIAs）
• 1.7.1 酶免疫分析法的原理和类型
• 1.7.2 酶免疫分析法的参数及指标
• 1.8 亲和层析（Affinity Chromatography,AC）
• 1.8.1 载体的选择
• 1.8.2 配基的选择
• 1.8.3 间隔臂的作用
• 1.9 免疫亲和柱（Immunoaffinity Chromatography,IAC）
• 1.9.1 抗体的纯化
• 1.9.2 抗原的纯化
• 1.9.3 免疫亲和层析技术的应用
• 1.10 论文研究目的及意义
• 1.11 论文研究内容
• 2.材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验样品
• 2.1.2 主要药品
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 常用溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 1-KLH）的制备（戊二醛一步法）'>2.2.1 人工免疫原（FB₁-KLH）的制备（戊二醛一步法）
• 1-OVA）的制备（戊二醛两步法）'>2.2.2 包被抗原（FB₁-OVA）的制备（戊二醛两步法）
• 1-HRP酶标抗原的联结'>2.2.3 FB₁-HRP酶标抗原的联结
• 2.2.4 抗体的制备与纯化
• 2.2.5 直接竞争酶联免疫（Direct competition ELISA,CD-ELISA）检测方法的建立
• 1-ELISA各项指标的评价'>2.2.6 FB₁-ELISA各项指标的评价
• 2.2.7 伏马毒素快速检测试剂盒的研制
• 2.2.8 伏马毒素免疫亲和柱（FB-IAC）的研究
• 3.结果与讨论
• 3.1 伏马毒素抗体的制备
• 3.1.1 抗血清效价与亲和力的变化
• 1抗体的纯化'>3.1.2 FB₁抗体的纯化
• 3.1.3 包被量和酶标抗原用量的优化
• 3.2 其他条件的优化
• 3.2.1 离子浓度对ELISA反应体系的影响
• 3.2.2 溶液pH值对ELISA反应体系的影响
• 3.2.3 有机溶剂对于ELISA反映体系的影响
• 3.3 标准曲线的绘制
• 3.4 样品的处理方法以及其基质影响的消除
• 3.4.1 样品的基质影响
• 3.4.2 基质影响的消除
• 1-ELISA各项指标的评价'>3.5 FB₁-ELISA各项指标的评价
• 3.5.1 检测限与灵敏度
• 3.5.2 精密度
• 3.5.3 伏马毒素CD-ELISA特异性
• 3.5.4 准确度
• 3.6 试剂盒稳定性研究与改进
• 3.6.1 抗体的稳定性
• 3.6.2 酶标抗原的稳定性
• 3.7 伏马毒素免疫亲和柱（FB-IAC）的研究
• 3.7.1 亲和柱的制备
• 3.7.2 FB-IAC操作条件的选择
• 3.7.3 样品的加标回收
• 4.结论
• 5.展望
• 6.参考文献
• 7.论文发表情况
• 8.致谢