rolB、rolC基因对转Ri质粒三倍体毛白杨的转化

论文摘要

Ri质粒上含有诱根基因即rol基因，将Ri质粒或单个或几个rol基因组合导入植物体内均能提高植物的生根能力，但是某些植物在转入rol基因后往往会使植株表现出一些不良的变异，如出现了植株矮化、叶面皱缩、节间缩短、分支能力增强等性状，对植物的生长发育产生很大的影响。为减少rol基因对植物造成的不良变异，本文以刘兴菊研究的转Ri质粒30148菌株的三倍体毛白杨3个无性系为研究对象，通过对叶片再生体系和遗传转化条件的优化，建立了高效离体再生系统和遗传转化体系，并将rolB、rolC诱根基因导入转Ri质粒的三倍体毛白杨，对部分转化再生植株进行了形态鉴定、PCR检测和GUS组织化学染色检测，并对转化植株形态及生长变异和叶片解剖结构进行了初步研究，主要研究内容及结果如下：1．进行了叶片外殖体高效再生系统的研究，筛选出转Ri质粒的三倍体毛白杨叶片诱导不定芽的适宜培养基为：MS+6-BA1.0mg．L-1+NAA0.05mg．L-1，诱导不定根的适宜培养基为：MS+NAA0.1mg．L-1。并以此种诱导不定芽的适宜培养基，研究了暗培养对诱导叶片不定芽的影响，结果表明，暗培养5d对不定芽诱导是有利的。2．通过卡那霉素（Km）敏感性试验，确定了诱导叶片外殖体不定芽的Km临界耐受浓度为30mg．L-1。同时研究了头孢噻肟钠（CTX）对诱导转Ri质粒的三倍体毛白杨叶片不定芽的影响和对农杆菌的抑菌效果，结果表明，CTX适宜的抑菌浓度为400mg．L-1。3．对影响农杆菌转化效率的几个主要因素进行研究发现，转Ri质粒的三倍体毛白杨叶片外殖体适宜的侵菌时间是8min，侵染后共培养2d可获得较好的转化效果。4．分别将含质粒pCMB-B∶GUS和pPCV002-CaMVC的农杆菌与转Ri质粒的三倍体毛白杨叶片共培养，通过在50mg．L-1Km的培养基上筛选后，获得了Km抗性植株，对部分抗性植株进行了PCR检测，证明rolB、rolC基因已整合到转Ri质粒三倍体毛白杨的基因组中，对部分PCR检测呈阳性的pCMB-B∶GUS转基因无性系进行组织化学染色分析表明，GUS基因主要在根尖、茎及叶脉维管束组织中特异表达。5．进行了转基因植株形态及生长变异的研究，发现与转Ri质粒三倍体毛白杨相比，大部分转rolB基因无性系植株矮化，叶面积增加，茎分支能力增强，节间距缩短，生根率及根数量降低，高生长量减少；大部分转rolC基因无性系叶面由原来的皱缩变为平展，茎分支能力增强，节间距缩短明显，生根率、根数量及高生长量增加。6．对转基因植株叶片解剖结构及组织厚度进行了观察，结果表明，转基因无性系叶片解剖结构变化不明显。大部分转rolB基因无性系叶片厚度、叶肉厚度与其转Ri质粒无性系对照相比差异显著，栅栏组织和海绵组织厚度差异不显著，50％的转rolB基因无性系的表皮厚度与其转Ri质粒无性系对照相比差异显著。大部份转rolC基因无性系叶片厚度、叶肉厚度与其转Ri质粒无性系对照相比差异不显著。转Ri质粒不同无性系在转rolC基因后，栅栏组织厚度变异程度不同，75％的转rolC基因无性系海绵组织厚度与其转Ri质粒无性系对照有显著差异。转rolC基因无性系的表皮厚度与其转Ri质粒无性系对照无显著差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究的目的及意义
• 1.2 rol基因研究概况
• 1.2.1 rol基因
• 1.2.2 rol基因在遗传改良中的应用
• 1.3 基因沉默、基因表达调控及基因功能的研究
• 1.3.1 转基因沉默
• 1.3.2 基因功能的研究方法
• 1.4 问题与展望
• 2 转Ri质粒三倍体毛白杨高效再生体系的建立
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 杨树组织培养基
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 毛白杨无菌苗的获得
• 2.2.2 诱导叶片不定芽适宜培养基的筛选
• 2.2.3 暗培养对不定芽诱导效果的影响
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 外殖体适宜消毒时间的选择
• 2.3.2 适宜培养基的筛选
• 2.3.3 暗培养对不定芽诱导效果的影响
• 3 转Ri质粒三倍体毛白杨遗传转化体系的建立与优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 质粒载体
• 3.1.2 植物材料
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 试剂
• 3.1.5 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 Km对诱导叶片不定芽的影响
• 3.2.2 CTX对诱导叶片不定芽的影响
• 3.2.3 CTX抑菌浓度的确定
• 3.2.4 遗传转化及筛选
• 3.2.5 转化条件的优化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Km对诱导叶片不定芽的影响
• 3.3.2 CTX对诱导叶片不定芽的影响
• 3.3.3 CTX对侵菌叶片的抑菌效果
• 3.3.4 不同侵染时间对转化效率的影响
• 3.3.5 共培养时间的确定
• 3.3.6 转rolB和rolC基因植株的筛选及获得
• 4 转基因植株的检测
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 质粒
• 4.1.3 主要药品试剂
• 4.1.4 重要仪器设备
• 4.1.5 PCR引物设计
• 4.2 方法
• 4.2.1 植物总DNA的提取（CTAB提取法）
• 4.2.2 农杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）
• 4.2.3 PCR检测
• 4.2.4 转rolB基因植株的GUS检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 转基因植株的形态鉴定
• 4.3.2 转基因植株的PCR检测
• 4.3.3 rolB-GUS基因表达的定位分析
• 5 转基因植株形态及生长变异研究
• 5.1 材料
• 5.2 试验方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 转基因无性系的形态变异
• 5.3.2 转rolB基因无性系的生长变异
• 5.3.3 转rolC基因无性系的生长变异
• 6 转基因植株叶片的解剖结构
• 6.1 材料
• 6.1.1 植物材料
• 6.1.2 主要药品仪器
• 6.2 研究方法
• 6.2.1 材料的选取及固定
• 6.2.2 石蜡切片的制备
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 转rolB基因试管苗叶片的解剖结构
• 6.3.2 转rolC基因试管苗叶片解剖结构的变异
• 7 讨论与结论
• 7.1 讨论
• 7.2 结论
• 参考文献
• 图版1
• 图版2
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢