鸡CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因的克隆、表达及其在肉质中的遗传效应分析

论文摘要

钙蛋白酶系统在细胞内普遍存在,主要包括钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白。钙蛋白酶（calpain,CAPN）是生物体内普遍存在的钙依赖性半胱氨酸蛋白酶,在活体中参与肌肉降解等许多细胞过程,在动物宰后影响肉的嫩度。钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin,CAST）是一种内源性的、需Ca2+激活的钙蛋白酶抑制剂,可抑制肌肉蛋白质降解,屠宰后可抑制钙蛋白酶的活性,降低蛋白质水解。研究表明:钙蛋白酶系统基因参与肌肉生长过程中蛋白质的更新,并且与动物肌肉的增长和嫩度有密切的相关。本研究以地方品种四川山地乌骨鸡为试验材料,克隆获得了山地乌骨鸡CAPN系统成员CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因的全编码区序列（GenBank accessionnumbers:FJ232589、FJ232590、FJ497056和FJ232592）,并翻译获得其氨基酸序列（705aa、700aa、810aa和768aa）。通过生物信息学分析表明:CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST蛋白都是亲水的、都可能是一种潜在的跨膜蛋白。同时都存在着calpain家族的催化结构域和共同特征。CAPN1、CAPN2、CAPN3蛋白的氨基酸序列与其它物种的同源性较高,CAST蛋白的氨基酸序列与其它物种的同源性较低。以地方品种四川山地乌骨鸡、藏鸡和培育优质鸡“大恒”S01系为试验材料,采用SYBR greenⅠ定量PCR分析CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因在1日龄和70日龄两个时间点品种间的表达差异,同时分析了四川山地乌骨鸡出生后1d、14d、28d、42d、56d、70d和84日龄等7个时间点CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因的组织表达差异和同一组织在不同时间点的发育性变化,以及CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST表达量的发育性变化同肌内脂肪含量、活重和冠重等三个表型性状累积生长值之间的关系。分析结果表明:除CAST基因在藏鸡的腺胃和肌胃组织外,CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因在同一组织中藏鸡和S01品系中基因表达量高于山地乌骨鸡。由此推测,CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因表达量与鸡的品种有关;CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因在四川山地乌骨鸡出生后的各个阶段都有表达,并且在不同阶段各有优势表达组织。胸肌和腿肌中CAPN1基因表达量的发育性变化与活重的累积生长值成显著地正相关,肌肉组织中CAPN2、CAPN3和CAST基因表达量的发育性变化与活重的累积生长值无显著地相关,但CAPN1、CAPN3和CAST基因在胸肌组织中都有表达的优势时间点。CAPN1基因在胸肌组织中表达规律在不同时间点总体呈上升的趋势,CAST基因在胸肌中表达量总体呈下降趋势,CAPN3基因在胸肌组织中表达规律总体呈先升后降的趋势。这与CAPN1、CAPN3和CAST基因在肌肉生长发育过程中理论表达量的规律很相似。胸肌组织中CAPN1分别与CAST和CAPN3表达量比值变化随机体的生长发育呈先升后降再升的趋势。由此推测,CAPN1、CAPN3和CAST基因表达量可能与鸡肌纤维的生长发育紧密相关,它们在鸡肌肉蛋白代谢中发挥重要调控作用。以地方品种广东惠阳胡须鸡、封开杏花鸡、清远麻鸡、广西霞烟鸡和四川大恒优质鸡8个品系等12个品系或品种。共310个个体为试验材料,采用测序和PCR-SSCP的技术设计引物,扫描CAPN1、CAPN3和CAST基因外显子序列和邻近内含子序列。结果显示:在CAPN1基因中检测到4个单核苷酸突变位点,分别位于外显子5、外显子6、外显子16和3’非编码区。具体为2546位（SNP1）由C→T（反向测序）,3535位（SNP2）由G→A,7198位（SNP3）由C→A和9950位（SNP4）由G→A（GenBank NO:NC006090.1）。4个SNP位点构成16种单倍型,其中单倍型H1（C-G-C-G）、H2（C-G-C-A）和H5（C-A-C-G）为优势单倍型。CAPN1基因单倍型与12个品系或品种的屠宰性状关联分析结果显示:单倍型组合对活重、屠体重、半净膛率、胸肌率、腿肌重和腿肌率的遗传效应达到显著水平（P＜0.05）。单倍型H1（C-G-C-G）对肌肉生长有负面效应,单倍型H9（T-G-C-G）和H13（T-A-C-G）对肌肉生长有正向效应。在CAPN3基因中检测到2个单核苷酸突变位点,分别位于内含子8和外显子10。具体为11818位（SNP1）由T→A,12814位（SNP2）由T→G（GenBank NO:NC006092.2）。2个SNP位点构成4种单倍型,其中单倍型H1（T-G）、H2（T-T）、H3（A-G）和H4（A-T）均为优势单倍型。CAPN3基因单倍型与12个品系或品种的屠宰性状关联分析结果显示:单倍型组合对半净膛率、胸肌率和腹脂重有显著地遗传效应。单倍型H1（T-G）对肌肉增长有负面效应,单倍型H2（T-T）对肌肉增长有正向效应,对腹脂重有负面效应。在CAST基因中检测到3个单核苷酸突变位点,分别位于外显子8、外显子11和内含子11。具体为36127位（SNP1）由T→C,37752位（SNP2）由A→T,37868位（SNP3）由G→A（GenBank NO:NC006127.2）。3个SNP位点构成8种单倍型,其中单倍型H1（T-A-G）、H2（T-A-A）、H3（T-T-G）和H4（T-T-A）为优势单倍型。CAST基因单倍型与12个品系或品种的屠宰性状关联分析结果显示:单倍型组合对活重、屠体重、半净膛率、全净膛率、胸肌重、胸肌率、腿肌重和腿肌率有显著地遗传效应。单倍型H3（T-T-G）对肌肉生长发育有正面效应,单倍型H5（C-A-G）和H6（C-A-A）对肌肉生长发育有负向效应。由此推测CAPN1、CAPN3和CAST基因可能是影响鸡屠宰性状的主效基因。单突变位点与肉质性状关联分析结果显示:CAPN1基因对剪切力和失水率有显著影响,CAPN3基因对失水率有显著影响,CAST基因对肌苷酸含量有显著影响。三基因突变位点对肉质性能的遗传效应需要进一步研究验证。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 常用词语缩写
• 第一章 文献综述
• 1.1 优质肉鸡的研究现状
• 1.1.1 优质肉鸡定义
• 1.1.2 鸡肉品质性状的研究
• 1.1.3 优质肉鸡研究及育种现状
• 1.2 家禽肌肉组织的发育与代谢调控
• 1.2.1 骨骼肌的发育
• 1.2.2 屠宰后肌肉代谢变化
• 1.2.3 家禽肌肉组织代谢调控关键因素
• 1.3 钙蛋白酶系统基因研究进展
• 1.3.1 CAPN1基因的研究进展
• 1.3.2 CAPN2基因的研究进展
• 1.3.3 CAPN3基因的研究进展
• 1.3.4 CAST基因的研究进展
• 1.3.5 钙蛋白酶系统在治疗疾病中的应用
• 1.3.6 钙蛋白酶系统的研究前景
• 1.4 分子标记技术及其在家禽育种中的应用
• 1.4.1 分子标记概述
• 1.4.2 目前检测基因突变的技术
• 1.4.3 目前检测基因表达的方法
• 1.4.4 MAS在家禽育种中的应用
• 1.4.5 分子标记技术的应用前景与展望
• 1.5 鸡肉质性状重要候选基因的研究概况
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因编码区的克隆及生物信息学分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试剂与仪器
• 2.2.3 试验方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 RNA质量
• 2.3.2 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因目的片段的扩增和克隆结果
• 2.3.3 目的片段的测序结果
• 2.3.4 鸡CAPN1基因生物信息学分析
• 2.3.5 鸡CAPN2基因生物信息学分析
• 2.3.6 鸡CAPN3基因生物信息学分析
• 2.3.7 鸡CAST基因生物信息学分析
• 2.3.8.鸡CAPN系统成员间序列分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 克隆cDNA序列分析
• 2.4.2 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST蛋白功能分析
• 2.4.3 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST蛋白确定序列特性分析
• 2.4.4 鸡CAPN系统成员间序列分析和保守域分析
• 2.4.5 蛋白质三维结构预测分析
• 2.4.6 系统发育分析
• 第三章 鸡CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因mRNA水平定量研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 试剂和仪器
• 3.2.3 试验方法
• 3.2.4 统计分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 常规PCR及测序结果
• 3.3.2 目的基因与管家基因的标准曲线及熔解曲线
• 3.3.3 荧光定量PCR扩增产物的特异性
• 3.3.4 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因的品种表达差异
• 3.3.5 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因的组织表达差异
• 3.3.6 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因表达的发育性变化
• 3.3.7 四川山地乌骨鸡各性状累积生长值
• 3.3.8 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因的相对表达量与性状的相关分析
• 3.3.9 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因表达量的倍比关系
• 3.4 讨论
• 3.4.1 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因表达量的品种差异
• 3.4.2 CAPN1基因相对定量结果及其与性状的相关分析
• 3.4.3 CAPN2基因相对定量结果及其与性状的相关分析
• 3.4.4 CAPN3基因相对定量结果及其与性状的相关分析
• 3.4.5 CAST基因相对定量结果及其与性状的相关分析
• 3.4.6 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因表达量的倍比关系
• 第四章 鸡CAPN1、CAPN3和CAST基因的多态位点筛选及其遗传效应分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 试剂和仪器
• 4.2.3 主要分子生物学软件
• 4.2.4 试验方法
• 4.2.5 统计分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 基因组DNA提取结果
• 4.3.2 鸡CAPN1基因的多态性及遗传效应
• 4.3.3 鸡CAPN3基因的多态性及遗传效应
• 4.3.4 鸡CAST基因的多态性及遗传效应
• 4.4 讨论
• 4.4.1 鸡CAPN1基因的多态性及遗传效应分析
• 4.4.2 鸡CAPN3基因的多态性及遗传效应分析
• 4.4.3 鸡CAST基因的多态性及遗传效应分析
• 第五章 结论
• 5.1 论文结论
• 5.2 论文创新点
• 5.3 进一步的研究工作
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录