应用蛋白质组学（2D-DIGE）技术寻找SHR-SP脑卒中疾病相关蛋白

论文摘要

高血压病（hypertension）发生率高,在中国成人高达18%,目前我国有1.6亿高血压病人。脑卒中（stroke）是高血压病最重要的并发症,中国高血压病人脑卒中的发生率要远远高于欧美国家的高血压病人。中国脑卒中年发病率为2‰,每年新发140万,现有累计700多万患者。脑卒中一旦发生,后果严重,病人往往非死即残。全球每年新发脑卒中1500万,其中500万人死亡,500万人永久性残废。中国每年死于脑卒中的人数约为140万。要使幸存者康复,耗时费力。中国每年因脑卒中直接支出374亿人民币。因此,就脑卒中而言,防止其发生比治疗更重要。如何预防脑卒中的发生?除了降低血压,目前尚无其他有效措施。甚至对于某些病例如缺血性脑卒中,降压治疗也并不能完全阻止脑卒中的发生。因此,有必要对脑卒中的病理生理机制进行深入的研究,找出除了血压以外的更多决定因素,针对这些因素进行处理,提出新的防治策略,从而更好地预防脑卒中的发生,大幅度地降低脑卒中的危害。脑卒中倾向的自发性高血压大鼠（Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rats, SHR-SP）是目前研究脑卒中最常用的动物模型,它是从自发性高血压大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats, SHR）里筛选出来、定向培育的亚种,具有自发性脑卒中倾向;换言之,并非所有的SHR都会发生脑卒中,SHR与SHR-SP同为高血压动物,但SHR-SP更易发生脑卒中,故采用SHR-SP与普通的SHR进行比较研究,有助于找到除了血压以外的其他决定因子,阐明脑卒中发生的病理机制。目前,对于某种疾病如脑卒中的研究多数只针对某种或某几种血清或组织中的影响因素,这些因素是基于某种假定成立的预期理论而预先选定的,这些研究的目的也只是为了证实或者推翻这些假定的理论。然而,蛋白质组学（proteomics）这一强大技术手段的出现,打破了上述这些常规手段的限制,可一次检测到成千上万种蛋白质,不局限于任何既定的理论框架,有利于发现新的蛋白质标志物,新的现象,以及新的作用机制。近年来,蛋白质组学结合生物信息学（bioinformatics）技术手段已经广为应用。而相对于普通的硝酸银染色,考马斯亮蓝染色等方法,双向荧光差异凝胶电泳（two dimensional fluorescent difference gel electrophoresis,2D-DIGE）则更加具有其优越性。2D-DIGE是唯一应用内标（Internal Standard）的蛋白质组学方法,内标是从一项实验中所有样品选取等量蛋白混合而成的,将会出现在每一张胶上,并由配套的分析软件以内标为基准分析所有检测到的蛋白表达差异情况,大大提高了实验的可信度。此外,实验组、对照组以及内标组样品分别由3种荧光标记后混合,同时进行一向和二向分离,最大程度的减少了实验过程中的系统误差,提高了实验的可信度。因此,建立2D-DIGE实验技术平台并应用以比较分析SHR-SP与SHR蛋白质表达、探求脑卒中发生发展新的内在机制正是本课题的主要研究目的。综上所述,本课题主要拟进行以下几个方面的研究:2D-DIGE实验技术平台的建立。采用SHR-SP与普通的SHR进行比较研究,应用2D-DIGE技术分离SHR-SP与SHR的脑组织蛋白,选取差异表达的蛋白进行串联质谱鉴定,并用western blot进行验证。在上述结果的基础上,深入分析差异蛋白在脑卒中发生中的作用。具体实验及结果如下:实验一:2D-DIGE技术平台的建立。以SHR-SP和SHR脑组织蛋白样品为例,以CyDye进行荧光标记,随后进行双向电泳分离蛋白,Typhoon Trio扫描获得荧光图像,配套的DeCyder分析软件对图像进行分析,获得差异蛋白信息。结果:成功的进行了样品的荧光标记测试、荧光标记及双向电泳,并对扫描得到的图像进行了分析。即,成功建立了2D-DIGE实验技术平台。实验二:SHR-SP与SHR脑组织差异表达蛋白的寻找及验证。利用2D-DIGE实验技术平台,比较分析SHR-SP和SHR脑组织差异蛋白的表达。20周龄雄性SHR-SP和SHR,各5只,提取脑组织蛋白进行双向荧光差异凝胶电泳,获得SHR及SHR-SP脑组织的差异蛋白表达谱。结果发现,在2000多个蛋白点中,找到44个显著性差异表达的蛋白,其中19个在SHR-SP高表达,25个低表达。其中20个蛋白得到基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱（MOLDI-TOF/TOF MS）鉴定,在鉴定到的差异表达的蛋白点中,9个在SHR-SP中高表达,11个在SHR-SP中低表达;其中抗氧化蛋白谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S-transferase,GST）在SHR-SP中显著下调（P<0.05）。Western Blot验证了这一结果,与2D-DIGE是一致的。实验三:SHR-SP氧化应激水平明显高于SHR。既然抗氧化蛋白在SHR-SP显著下调,我们比较了SHR-SP和SHR的氧化应激水平。20周龄雄性SHR-SP和SHR,各10只,提取脑组织蛋白样品及制备血清样品,比较了两者抗氧化防御系统中总抗氧化能力（total antioxidant capacity,TAC）,谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPx）活性和丙二醛（maleic dialdehyde, MDA）含量。结果发现SHR-SP脑中TAC和GPx均显著低于SHR （12.47±3.02 vs 22.73±3.00, P<0.01; 891.81±108.93 vs 1124.4±160.06, P<0.05）,而MDA含量却显著高于SHR（1.11±0.11 vs 0.82±0.11, P<0.05）。血清中也得到了一致的结果,SHR-SP组TAC和GPx显著低于SHR（61.28±15.16 vs 123.6±32.39, P<0.05; 12.14±1.77 vs 18.59±2.42, P<0.05）,而MDA含量显著高于SHR（13.33±2.90 vs 5.89±1.21, P<0.05）。实验四:SHR-SP脑梗死面积明显大于SHR。我们接下来比较了SHR-SP和SHR的脑梗死面积。20周龄雄性SHR-SP和SHR,各15只,电凝法进行大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）手术。术后24 h,行氯化三苯基四氮唑（2,3,5’- Triphenyl Tetrazulium Chloride, TTC）染色,计算机分析系统计算脑梗死面积百分比。结果发现,SHR-SP脑梗死面积显著高于SHR,两者有显著差异（23.0 %±3.3 % vs 31.6 %±5.4 %, P=0.004）。实验五:维生素C和维生素E合用可以改善SHR-SP的氧化应激水平、减小脑梗死面积。通过以上实验结果,我们推测SHR-SP脑梗死严重可能与其氧化应激损伤较严重有关,本实验对此进行了验证。我们选用最常见的抗氧化剂维生素降低氧化应激水平,减少氧化损伤,再观察脑梗死情况是否减轻。50只16周龄雄性SHR-SP随机分为两组:对照组（n=25）和VCE组（Vitamin E （100mg/kg.d） +Vitamin C （200mg/kg.d）, n=25）,连续灌胃4周。（1）4周后,检测氧化应激指标TAC、GPx和MDA,每组10只。结果显示,VCE组脑中TAC和GPx活性均显著高于对照组（25.57±6.68 vs 12.47±3.02, P<0.05; 1453.11±126.98 vs 891.81±108.93, P<0.01）,MDA含量则显著低于对照组（0.80±0.05 vs 1.11±0.11, P<0.05）。血清中得到了一致的结果,VCE组TAC和GPx活性显著高于对照组（124.75±28.43 vs 61.28±15.16, P<0.05; 19.63±4.84 vs 12.14±1.77, P<0.05）,MDA含量则显著低于对照组（7.31±0.86 vs 13.33±2.90, P<0.05）。（2）余下的30只SHR-SP,其中15只连续给维生素4周,对照组给蒸馏水,4周后电凝法行MCAO手术。术后24 h,行TTC染色,计算机分析系统计算脑梗死面积百分比。结果发现,VCE组脑梗死面积显著低于对照组,两者有显著差异（20.8 %±3.8 % vs 32.0 %±4.9 %, P=0.003）。结论:成功建立了2D-DIGE实验技术平台,可以有效的进行蛋白质差异表达检测。应用2D-DIGE技术手段获得了SHR-SP和SHR脑组织的差异表达蛋白列表。其中,抗氧化蛋白在SHR-SP中显著下调。氧化应激与脑卒中的发生有着密切关系,氧化应激的增强是引起脑卒中的一个重要因素。一方面SHR-SP与SHR氧化应激水平有差异:SHR-SP氧化损伤比SHR严重,同时其抗氧化防御能力又弱于SHR;SHR-SP脑梗死面积明显大于SHR。另一方面,给予抗氧化剂Vitamins提高了SHR-SP的抗氧化能力,并减少其氧化损伤;减少氧化应激可显著减少SHR-SP脑梗死面积。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写表
• 第一部分 双向荧光差异凝胶电泳实验平台的建立
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 SHR-SP与SHR脑组织差异蛋白表达谱研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三部分 SHR和SHR-SP氧化应激水平及脑梗死面积的比较研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四部分 SHR-SP维生素抗氧化处理后氧化应激以及脑梗死面积的比较研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 综述
• 附录
• 致谢