马铃薯StTm-2基因的克隆和表达分析

论文摘要

马铃薯是世界第四大粮食作物,在我国粮食、蔬菜、饲料和加工原料生产上占有重要地位。病毒病一直是马铃薯生产发展的一大障碍,其不仅影响了马铃薯品种退化、产量下降更重要的是影响了马铃薯的品质。传统的育种方式已经不能满足马铃薯生产的需要,所以利用基因工程技术结合传统的育种技术进行马铃薯新品种的培育是当前马铃薯生产最需解决的问题。本研究目的在于利用番茄与马铃薯高同源性特点培育多抗,耐储藏马铃薯品种做前期的理论和技术基础研究,所取得的主要结果如下:1、对长期种植筛选出的番茄品系KBV进行抗性鉴定。结果证明该番茄品系KBV对TMV、ToMV高抗。根据已报道的番茄抗性基因Tm-22设计特异性引物通过RT-PCR扩增得到2238bp的片段PF1R1,经比对证实KBV为含Tm-22基因的番茄品系。2、根据Tm-22基因与Tigr Blast中报道的部分序列相比对,通过简并引物的设计,利用RT-PCR和RACE技术扩增出Tm-22基因在马铃薯同源基因StTm-2的全长cDNA序列,在Gene Bank中的登录号为EF137705。经序列分析表明,该基因cDNA序列全长2547bp,包含一个完整的开放阅读框。该cDNA编码849个氨基酸,推测蛋白质分子量为96891.5Da,等电点为7.65,与番茄Tm-22及拟南芥RPS2的氨基酸序列同源性分别为76%与31%。拥有两个跨膜结构。以及抗性蛋白所特有的NBS结构区域,固我们推测该基因为NBS类抗性或抗性相关基因。利用Northern技术对StTm-2在马铃薯组织中的表达情况做了研究,结果发现该基因在地上部分组织中的表达明显强于底下部分与Tm-22基因在番茄中的表达相似。3、对已报道的试管薯诱导技术进行简单的改进,即转接入诱导培养基的马铃薯组织不经过光照培养直接进行黑暗处理,能在较短的时间里诱导出试管薯。并研究在这样的诱导体系下不同类型培养基、不同糖份以及激素对诱导的影响。最后利用实验室已构建好的载体对其转化体系进行摸索,因时间关系,本人仅得到可抗性芽,随后的生根筛选正在进行中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 利用病毒基因介导的抗性策略
• 1.1.1 利用病毒外壳蛋白（coat protein,CP）基因介导病毒抗性
• 1.1.2 复制酶介导的保护作用(replicase mediated protection.
• 1.1.3 利用病毒运动蛋白（movement protein,MP）基因介导的病毒抗性
• 1.1.4 利用卫星RNA 介导的抗性
• 1.1.5 利用核酶基因介导的抗性策略
• 1.2 利用植物自身R 基因或RGA 基因策略
• 1.2.1 植物自身基因介导的病毒抗性
• 2 研究进展'>1.2.2 番茄抗病毒基因Tm-2²研究进展
• 1.2.3 植物RGA 基因的应用策略
• 1.2.4 PR 蛋白基因
• 1.2.5 利用核糖体失活蛋白RIPs 基因
• 1.3 马铃薯抗病毒育种的研究进展
• 1.4 本论文研究目的、意义与内容
• 1.4.1 研究目的及意义
• 1.4.2 研究内容
• 1.5 本论文研究的创新点
• 2 番茄品系KBV 抗性鉴定
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果分析
• 2.4 讨论
• 2 基因片段克隆'>3 番茄品系KBV 中TM-2²基因片段克隆
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 植物材料、质粒、菌株、试剂
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 常用试剂配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 番茄叶片总RNA 提取
• 3.2.2 番茄叶片基因组DNA 提取
• 3.2.3 核酸质量及浓度测定
• 2 基因片段的克隆'>3.3 番茄TM-2²基因片段的克隆
• 3.4 结果与分析
• 3.5 讨论
• 2 超表达载体的构建'>4 番茄TM-2²超表达载体的构建
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 植物材料、质粒、菌株
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 主要化学试剂和试剂盒
• 4.1.4 实验所用试剂的配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 质粒DNA 的制备
• 4.2.2 质粒的酶切及连接
• 4.2.3 载体构建
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 5 试管薯诱导及转化体系的摸索
• 5.1 材料与试剂
• 5.1.1 植物材料、质粒、菌株
• 5.1.2 主要仪器设备
• 5.1.3 主要化学试剂和试剂盒
• 5.1.4 实验所用试剂的配制
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 基础材料的获得及试管薯的诱导
• 5.2.2 不同条件对试管薯诱导的影响
• 5.2.3 农杆菌介导的试管薯转化体系的摸索
• 5.3 结果分析
• 5.4 讨论
• 6 马铃薯STTM-2 基因的全长CDNA 的克隆
• 6.1 材料与试剂
• 6.1.1 植物材料、质粒、菌株、试剂（同上3.1.1）
• 6.1.2 主要仪器设备（同上3.1.2）
• 6.1.3 常用试剂配制（同上3.1.3）
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 马铃薯叶片总RNA 提取（同上3.2.1）
• 6.2.2 马铃薯叶片基因组DNA 提取（同上3.2.2）
• 6.2.3 核酸质量及浓度测定（同上3.2.3）
• 6.3 STTM-2 基因的全长CDNA 的克隆
• 6.3.1 StTm-2 部分片段的克隆
• 6.3.2 StTm-2 3’端cDNA 序列扩增
• 6.4 结果与分析
• 6.5 讨论
• 7 STTM-2 基因在马铃薯不同组织中的表达
• 7.1 材料与试剂
• 7.1.1 植物材料及处理
• 7.1.2 主要仪器设备
• 7.1.3 主要化学试剂和试剂盒
• 7.1.4 常用试剂配制
• 7.2 方法
• 7.2.1 总RNA 的制备
• 7.2.2 Northern 杂交
• 7.3 结果与分析
• 7.4 讨论
• 8 结论与展望
• 8.1 主要结论
• 8.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录