番木瓜环斑病毒海南分离物（PRSV-HN）全基因组克隆与序列分析

论文摘要

番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus）是国内外番木瓜产区分布最广、为害最严重的病毒之一,其严重危害番木瓜的产量和质量,并降低其商品价值,同时也会危害葫芦科作物。本研究针对引起番术瓜环斑病毒病的一个PRSV海南海口分离物（PRSV—HN）的基因组RNA进行了全序列测定,并对PRSV—HN基因组核苷酸序列及其推导的氮基酸序列进行了结构和功能分析,这为在分子水平上研究PRSV遗传变异、侵染及发病机制奠定理论基础。以病毒RNA为模板反转录合成cDNA,利用保守序列设计引物,将PRSV—HN基因组分段进行PCR扩增,通过目的片段连接、转化、筛选、测序和序列拼接后获得该分离物的编码区序列。利用快速cDNA术端扩增方法（RACE）获得了该分离物完整的5’-非编码区序列。基因组全序列在GenBank中的登录号为:EFl83499。序列分析结果表明:PRSV—HN基因组全序列共10323个核鞑苷酸,5’-和3’-非编码区序列分别为85和209个核苷酸（不包括po1yA尾）,中间为10029个核苷酸的单一开放阅读框架,编码一个3343个氨基酸的多聚蛋白:该蛋白自身催化裂解为10个多肽,相邻多肽问的切割位点顺次为:Y/N,G/G,Q/A,Q/s,Q/G,Q/G, E/G,Q/S和Q/S。将PRSV-HN分离物与目前已报道的12株PRSV全基因组序列进行比较,结果表明,基因组序列核苷酸数目存在一定的差异,为10317bp-10332bp,主要是由在cP基因N端富A区出现了三联体缺失现象。PRSV-HN与12株PRSV的基因组核苷酸全序列同源性为82.3%-89.1%,编码的多聚蛋白氨基酸序列同源性为89.8%-93.1%。5-UTR同源性较低,仅65.9%-87.1%,而3—UTR同源性较高,达到90.8%-96.6%。Pl蛋白是病毒编码蛋白巾变异最大的,氨基酸序列同源性仅为65.4%-80.1%,而HC—Pro、CI及CP同源性较高。拿长氨基酸序列N-J树显示,PRSV分离物问存在三个进化相关簇群,W-W、W-1、HA以及Mex-Vrpo彼此非常相似,成为一个簇群。DEL分离物形成一独立的分支。Thai-1、Thal-2、HN以及来源于台湾的五个分离物（YK,TW-l,TW-2, TW-3,CI）形成一个进化簇。进化树显示,尽管DE1L分离物与美洲分离物更接近,但总体而言美洲分离物与亚洲分离物的分化与地理分布有一定的相关性。另外,进化树分布也显示,病毒的进化方向与P型和W型无明显十目关性。PRSV-HN全长核苷酸序列与Thai-1、Thai-2以及来源于台湾的五个分离物（YS,TW-l,TW-2,TW-3,CI）同源性最高,然而,却仅为88.4%-89.1%;而且,进化树显示,PRSV—HN单独形成一独立的分支。因此,建议将PRSV-HN与Thai-l、Thai-2以及来源于台湾的五个分离物归于不同一株系。将PRSV—HN分离物与部分已报道的PRSV分离物的外壳蛋白氨基酸序列作了比较和进化树分析,结果表明,PRSV- HN与中国株系YS的亲缘性最高。对P3蛋白的研究表明该蛋白内存在跨膜结构,可能与该病毒在寄主细胞内的传播有关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 一 文献综述
• 1 番木瓜环斑病毒（PRSV）的研究现状
• 1.1 前言
• 1.2 番木瓜环斑病毒
• 1.2.1 症状
• 1.2.2 病毒粒子特性
• 1.2.3 传播途径
• 2 马铃薯丫病毒属病毒研究进展
• 2.1 马铃薯丫病毒属病毒的生物学特性
• 2.2 马铃薯Y 病毒属基因组结构与功能
• 2.2.1 非翻译区（NTR）
• 2.2.2 P1 蛋白
• 2.2.3 HC-Pro 蛋白
• 2.2.4 P3 蛋白
• 2.2.5 其它
• 3 防治研究
• 3.1 番木瓜抗病育种和组培研究
• 3.2 弱株系的研究和利用
• 3.3 基因工程抗病性
• 3.3.1 外壳蛋白（Coat Protein，CP）基因介导的抗性
• 3.3.2 复制酶（replicase ,RP）基因介导的抗性
• 3.3.3 运动蛋白（Movement Protein, MP）基因介导的抗性
• 3.3.4 其他基因介导的抗性
• 4 本研究的目的意义和技术路线
• 4.1 目的意义
• 4.2 技术路线
• 二 材料和方法
• 1 材料和试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 菌株与载体质粒
• 2 方法
• 2.1 病毒RNA 的抽提
• 2.1.1 总RNA 提取
• 2.1.2 RNA 纯度及完整性检测
• 2.2 病毒基因组全序列的扩增
• 2.2.1 中间序列的RT-PCR
• 2.2.2 末端序列的测定:3'-RACE 和5'-RACE
• 2.2.3 PCR 扩增全长
• 2.3 PCR 产物纯化
• 2.4 回收的PCR 片段与T-载体连接
• 2.5 感受态细胞的制备
• 2.6 重组质粒转化感受态细胞
• 2.7 质粒载体的小量制备（碱裂法）
• 2.8 重组质粒的鉴定
• 2.9 序列测定和分析
• 三 结果与分析
• 1 感病总RNA 的电泳检测
• 2 基因组各段RT-PCR 及末端RACE 扩增检测
• 3 一步法RT-PCR 扩增PRSV-HN 分离物全序列
• 4 病毒基因组结构与功能的分析
• 4.1 PRSV-HN 分离物基因组全序列和ORF 结构分析
• 4.2 PRSV-HN 分离物ORF 编码的聚合蛋白酶切位点分析
• 4.3 PRSV-HN 分离物与12 株PRSV 全基因组序列特征的比较
• 4.3.1 PRSV 基因组酶解位点
• 4.3.2 PRSV 基因组核苷酸数目
• 4.3.3 核苷酸、氨基酸序列同源性
• 4.3.4 系统进化树分析
• 4.4 PRSV-HN 分离物基因组结构保守基序及其功能分析
• 四 讨论
• 1 利用RACE-PCR 获得末端序列
• 2 长片段的RT-PCR
• 3 PRSV-HN 分离物CDNA 克隆的可能利用价值
• 3.1 研究病毒运动
• 3.2 研究病毒基因功能
• 五 主要结论与进一步研究的建议
• 1 主要结论
• 2 进一步研究的建议
• 参考文献
• 论文涉及的部分缩略词（Abbreviation）
• 致谢