体外诱导大鼠骨髓干细胞转化为肝干细胞特征的研究

论文摘要

研究背景:骨髓干细胞（Bone Marrow Stem Cells,BMSCs）是一种具有多向分化潜能及自我复制功能的早期未分化细胞,其易分离、纯化和扩增,是细胞治疗中的理想干细胞来源[1-3]。骨髓干细胞主要有造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）两大类已经被证实。近年随着骨髓干细胞研究增多及深入,发现骨髓干细胞不仅能分化成同胚层的细胞,而且能跨胚层分化为其他细胞。如在适当的诱导条件下能分化为神经细胞、心肌细胞、脂肪细胞、骨和骨骼肌细胞等多种组织细胞[4-10],进一步研究发现,骨髓干细胞也可以分化为肝干细胞。目前认为肝干细胞是体内存在的一种具有自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞。大量研究证实成体肝脏内存在肝干细胞,卵圆细胞作为一种肝干细胞可分化为肝细胞和胆管上皮细胞[11-12],它在肝损伤时积极参与肝组织的修复。目前关于骨髓干细胞诱导分化为肝细胞的报道较多,但关于骨髓干细胞向肝干细胞诱导分化的报道尚少,因此本实验依此为切入点,在体外进行骨髓干细胞向肝干细胞转化的研究。肝脏疾病是临床的常见病多发病,而传统治疗方法对终末期肝病的疗效有限,原位肝移植（orthotopic liver transplantation,OLT）是公认较有效的治疗手段,但因供肝短缺,技术复杂而难以普遍应用;生物人工肝、肝细胞移植治疗与原位肝移植治疗比较,具有操作简单、可重复性强、一肝多用、供肝细胞免疫原性低且可冻存、移植失败或产生免疫排斥后对受体影响小等优点,此外,肝细胞在体外还可以进行基因修饰,是一个良好的基因治疗载体,故肝细胞移植被认为是理想的治疗方法。因肝细胞来源受限制,所以干细胞的研究为利用干细胞移植和/或干细胞工程生产肝细胞来治疗各种肝病提供了可能性。研究目的:①实验模拟肝脏发育的微环境,在体外诱导大鼠骨髓干细胞向肝干细胞分化;②探索在体外大鼠骨髓干细胞分化为肝干细胞的可行性及在诱导分化过程中的特征;③对诱导分化的肝干细胞进行形态和功能的鉴定;④为肝干细胞移植治疗作实验准备。实验方法:无菌条件下取大鼠双侧股骨及胫骨,冲洗骨髓腔,获取骨髓液,采用密度梯度分离法分离培养骨髓干细胞,设诱导组和非诱导组,应用肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）25ng/mL、成纤维生长因子-4（Fibroblast Growth Factor-4,FGF-4）10ng/mL、干细胞生长因子（Stem Cell Factor,SCF）10ng/mL共同诱导,于诱导的第0、7、14、21、28天,观察细胞形态变化;采用放射免疫法检测培养上清液中甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）浓度;免疫细胞化学染色检测甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白19（cytokeratin19,CK19）、白蛋白（albumin,ALB）的表达;PAS糖原染色法测定诱导细胞中糖原的表达;流式细胞仪检测诱导细胞中AFP、ALB阳性表达细胞比例。结果:①诱导培养的骨髓干细胞呈卵圆形或圆形的肝干细胞样改变;②放射免疫法检测到诱导组细胞甲胎蛋白浓度逐渐升高,第14d达高峰,随后呈下降趋势,与非诱导组相比,除第0,7d无差异,其余各时间点差异均显著（P<0.05）;③免疫细胞化学法检测到诱导组细胞特异性表达甲胎蛋白、细胞角蛋白19及白蛋白;非诱导组基本不表达三种蛋白;④P AS糖原染色法检测到在诱导21d和28d的细胞中糖原表达呈阳性;⑤流式细胞分析诱导组第14d甲胎蛋白阳性细胞比例为66.20%、诱导第28d白蛋白阳性细胞的比例为80.14%。结论:①采用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功分离骨髓单个核细胞,且生长活力和纯度均较好。②细胞种植密度在（5-10）×105个/cm2最有利于细胞生长;培养液中FBS浓度在10%-15%之间时,对骨髓干细胞增殖最有利。③HGF、FGF-4、SCF构建联合诱导体系,适合于诱导骨髓干细胞向肝干细胞的分化,且三者相互协调作用于诱导分化的整个过程。④骨髓干细胞在体外能分化为肝干细胞样细胞,诱导细胞有分泌甲胎蛋白、细胞角蛋白19、白蛋白的特征性功能。⑤骨髓干细胞可以作为肝组织工程主要的种子细胞来源。骨髓干细胞易于获得,操作方便,体外易于存活,使之成为组织工程学优良的种子细胞。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文
• 1 前言
• 2 实验材料
• 2.1 动物
• 2.2 主要试剂
• 2.3 仪器与设备
• 2.4 主要试剂的配制
• 3 实验方法
• 3.1 大鼠骨髓单个核细胞的分离
• 3.2 新分离的骨髓干细胞活力测定
• 3.3 骨髓干细胞体外培养及诱导分化
• 3.4 放射免疫法检测培养上清液中甲胎蛋白浓度
• 3.5 免疫细胞化学染色法检测细胞中AFP,ALB,CK19的表达
• 3.6 细胞代谢功能检测:细胞糖原染色
• 3.7 流式细胞术检测表达AFP,ALB阳性细胞的比例
• 3.8 统计学处理
• 4 结果
• 4.1 细胞形态学观察
• 4.2 台盼蓝染色法检测细胞活力
• 4.3 放射免疫法检测细胞培养上清液中AFP浓度结果
• 4.4 免疫细胞化学染色法检测AFP,CK19,ALB的结果
• 4.5 糖原染色结果
• 4.6 流式细胞分析结果
• 5 讨论
• 5.1 骨髓干细胞的分离和培养
• 5.2 诱导分化细胞的鉴定
• 5.3 诱导分化的条件和细胞因子在诱导中的作用
• 5.4 展望
• 6 结论
• 7 参考文献
• 附录
• 个人简历
• 致谢
• 综述：骨髓干细胞诱导分化为肝系细胞的研究进展
• 参考文献