——核酸适配体免疫层析法的研究
1蛋白质研究平台中国科学院生物物理所北京100101；2北京四中国际部北京100031
摘要：膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，膀胱镜检术和尿脱落细胞学检查是诊断膀胱癌的金标准，目前还没有高特异性的肿瘤标志物作为膀胱癌的早期诊断的指标。膀胱癌表面抗原特异性核酸适配体（aptamer）是体外人工合成、筛选获得的单链寡核苷酸（DNA或RNA），借其自身形成的空间结构与表面抗原特异性识别，又被称为化学抗体，其自身稳定性好、制备合成相对简单、快速、易获得、易功能化修饰和标记。利用氨基化的特异性膀胱癌核酸适配体与时间分辨荧光微球偶联，基于免疫夹心法原理，采用侧向层析技术，对膀胱癌细胞进行检测，灵敏度可达100细胞/ml；应用该方法检测阳性膀胱癌病人尿液样本，结果均为阳性。
关键词：膀胱癌；核酸适配体；免疫夹心法；时间分辨免疫层析法
一、研究背景和目的
1.膀胱癌
膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，具有多灶性、术后易复发的特性。预后较差和极易复发是膀胱癌的最大特点，也是临床的一个重要难题。目前用于膀胱灌注预防复发的药物主要有抗肿瘤化疗药物及免疫增强剂，但是这些药物由于特异性差、肿瘤多药耐药性等问题的存在，总体疗效并不理想。高达40%～80%的患者要发生一次或多次复发，10%～15%的患者发展为更高级别的肿瘤或发生转移。以上药物或者由于分子量小（如各类化疗药物）可非特异性地作用于全膀胱及尿道，经膀胱及尿道粘膜吸收后，产生局部及全身的毒副作用；或者会诱发迟发型超敏反应，引起强烈的局部炎症（如卡介苗）。膀胱镜检术和尿脱落细胞学检查是诊断膀胱癌的金标准，但膀胱镜检术的侵入性以及尿脱落细胞学检查的敏感性、特异性低，很难早期发现膀胱癌以及术后复发病灶。因此为膀胱癌的早期诊断、监测术后复发寻找一种新的检测手段已成为研究的热点问题。
由于膀胱癌致癌作用的分子机理尚不明确，目前还没有高特异性的肿瘤标志物作为膀胱癌的早期诊断的指标，寻找膀胱癌特异性强的肿瘤标志物一直是研究的热点。目前报道的膀胱癌标志物有：人补体因子H相关蛋白（BTA），核基质蛋白22（NMP22），尿透明质酸（HA）等。在临床应用过程中发现，上述膀胱肿瘤标志物的特异性普遍较细胞学差，在患有其它肿瘤或良性病变时会出现假阳性。肿瘤标志物的检测多采用双抗体夹心免疫分析方法，提取膜蛋白或者重组膜蛋白时可能会发生构象以及结构上的变化，制备单克隆抗体将影响细胞检测的灵敏度，识别肿瘤细胞时出现假阴性。
研究组一直致力于膀胱癌分子机制的研究，首次鉴定发现膀胱癌特异性单抗识别的膀胱癌细胞靶点。通过人全基因组基因芯片和膀胱癌不同分期分级的组织芯片，结合RT-PCR、Northern杂交及免疫组化，进一步证实新靶标只表达于人膀胱癌组织的细胞膜上，并与膀胱癌的肿瘤分期和病理分级呈正相关。该靶标属于一种全新的人膀胱癌肿瘤标记物。针对上述标志物，已通过杂交瘤技术筛选到一株具有高灵敏度和特异性的抗人膀胱癌单抗BCMab1，进行了大量细胞水平、动物水平的研究，并且鉴定了BCMab1单抗的特异性、亲和力和组织交叉反应性。实验结果表明BCMab1单抗是膀胱癌诊断极具临床应用价值的有效工具。
2.核酸适配体
核酸适配体（aptamer）是一段长度为80到100nt的单链RNA（ssRNA）或单链DNA（ssDNA）片段，通过配体指数富集法进化系统（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX）技术体外合成筛选获得的单链寡核苷酸，能够与靶分子进行特异性结合，被称为化学抗体。核酸适配体（aptamer）既可以具体识别肿瘤细胞表面的膜蛋白，又可以整体的识别肿瘤细胞，识别肿瘤细胞时不需要鉴定肿瘤细胞的特定细胞膜表面标志物。且aptamer易体外合成，稳定性高、结合力强、特异性强、易化学修饰，可实现多种标记，其在肿瘤细胞检测上的应用在某种程度上可取代生物学抗体。
3.时间分辨免疫荧光层析法
时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）是在传统荧光分析的基础上创立的一种新型非放射性免疫分析技术。TRFIA以含有镧系稀土元素的纳米微球作为标记物的，根据镧系金属螯合物荧光持续时间长且Stokes位移大，用时间分辨技术测量荧光，有效排除非特异性荧光的干扰，具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等特点。
图2.试纸条结构：由样品垫、标记物结合垫（含荧光微球交联的标记抗体1）、NC膜（含捕获抗体2及二抗）、吸水纸以及底板组成。
时间分辨免疫荧光层析法检测原理：将含有待测物的样品滴在加样区，待测样品中的抗原（抗体）与结合垫中的荧光纳米微球标记的配体结合并通过毛细作用向前层析；当达到检测区后，与检测线上固定的抗体（抗原）结合，形成微粒-配体-待测物-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，与固定在质控线二抗结合。应用干式荧光免疫分析仪，通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
4.研究目的
目前生物分子检测通常采用抗原抗体特异相互作用识别模式，但由于受到抗体易失活、制备时间较长等因素的影响，在一定程度上限制了抗体检测技术的广泛应用。相比之下，核酸适配体自身稳定性好、制备合成相对简单、快速、易获得、易功能化修饰和标记，且在生物传感器设计中应用灵活，近几年在生物分析检测方面备受关注，目前已经成为肿瘤临床诊断、环境监测、药学研究等许多领域中的研究热点。
随着SELEX技术的发展、临床检测需求的增加，广大学者开始致力于病毒、细菌、肿瘤细胞及标志物等方面的筛选，并且取得了相应的进展。目前，随着适配体筛选技术的不断提高，愈来愈多的学者们逐渐将目光聚集在肿瘤标志物以及肿瘤细胞适配体的筛选上。
肿瘤细胞学在癌症诊断方面，有细胞形态学分析和细胞计数两种分析形式来定性和定量检测肿瘤细胞。由于膀胱癌细胞间的粘附力极弱，因此尿脱落细胞的检测是膀胱癌诊断的最直接证据，可有效应用于早期肿瘤诊断、术后跟踪观察、预后评估等方面，也是肿瘤复发的有力监测手段。因此目前越来越多的研究关注循环（脱落）肿瘤细胞检测新方法开发。但是脱落的肿瘤细胞一方面数目少，另一方面肿瘤细胞在血液中与血细胞相比、在尿液中与正常上皮细胞相比，出现的频率（frequency）低。因此要求在肿瘤细胞的检测方法一要灵敏，二要准确。即方法的检测灵敏度高，细胞探针的靶向识别特异性高。
我们基于前期研究工作，筛选优化特异性高、结合力强的膀胱癌核酸适配体，应用时间分辨免疫荧光层析技术，建立检测膀胱癌循环（脱落）肿瘤细胞的新方法。
二、研究内容
1.膀胱癌核酸适配体筛选与优化
制备单链DNA库，通过荧光激活流式细胞仪（FACS）cell-SELEX技术筛选膀胱癌细胞特异aptamer，优化出最佳膀胱癌细胞特异的aptamer。研究组这部分内容已较成熟，仅作为掌握制备方法，重复优化已有实验结果，用于后续研究。
2.时间分辨免疫荧光层析法的建立
对膀胱癌细胞特异aptamer进行化学修饰获得抗核酸酶水解，能稳定保存的aptamer。进一步进行分子外修饰，在aptamer上链接含12碳链的氨基基团，经活化与时间分辨免疫荧光微球偶联。制备aptamer特异性多克隆抗体，作为时间分辨免疫层析法中的质控线（C线）。同时，应用膀胱癌特异性抗体BC1作为检测线（T线），建立膀胱癌细胞时间分辨免疫荧光层析检测法。应用该检测法检测膀胱癌细胞及阳性病人尿液样本。
三、研究方法和结果
1.膀胱癌核酸适配体筛选与优化
FACScell-SELEX技术筛选膀胱癌细胞特异aptamer
①结合FACS进行aptamer的膀胱癌cell-SELEX，整体流程主要包括三部分内容：设计引物，构建、合成单链DNA库，筛选与细胞有高结合常数的DNA库；
②FACScell-SELEX技术筛选与膀胱癌靶细胞特异结合的DNA库；用EJ人膀胱癌细胞系作为靶标细胞，HCV29、LoVo、HeLa、K562、HepG2、Jurkat、293等十余种细胞系作为阴性质控细胞。先进行阳性选择，所得的单链DNA库经阴性质控细胞筛选，除去非特异的单链DNA，所得单链DNA经PCR扩增后，完成一个cell-SELEX循环。经过10次循环，将最终所得膀胱癌细胞系特异的单链DNA与膀胱癌组织细胞阳性结合筛选，得到精确的、膀胱癌细胞特异单链DNA。
③筛选的单链DNA进行克隆、测序，经PCR扩增、克隆、测序获得已知序列的aptamer。
④所得的人膀胱癌细胞特异aptamer首先进行分子内化学修饰，防止核酸酶的降解。
⑤采取分子外修饰aptamer，外连12碳链的氨基基团，使aptamer氨基化，便于下一步与羧基荧光微球偶联。
采用的cell-SELEX技术原理如图3所示
图3.Cell-SELEX方法筛选膀胱癌细胞特异DNA适配体流程图
2.时间分辨免疫荧光层析法的建立
2.1时间分辨荧光微球与aptamer偶联
1）取100ul羧基荧光微球，将其悬浮在800ul的MES缓冲液中；
2）使用MES缓冲液新鲜配制NHS和EDC，各取20ul加入到微球中，室温活化30分钟。离心清洗去除上清，重悬于900ulMES缓冲液中。
3）取0.1mg膀胱癌aptamer加入到微球中，振荡混匀，室温旋转反应2小时。
4）加入100ulBSA封闭液，室温反应2小时。
5）离心，用Tris缓冲液（PH8.0）重悬，超声分散。重复洗涤两次。
6）末次离心后，去上清，用微球保存液重悬；放置在4℃，切勿冻存！
2.2时间分辨免疫荧光层析试纸条制备
1）NC膜的制备
将NC膜裁成25mm*300mm，非点样面粘贴在PVC胶板上，位置如图所示。
将BC1单克隆抗体和兔抗膀胱癌核酸适配体抗体用含1%蔗糖的Tris-HCl缓冲液分别稀释为1.0mg/mL和0.5mg/mL。
用划线喷金仪以100mm/s的速度、1μL/cm的浓度，分别将BC1单克隆抗体、兔抗膀胱癌核酸适配体抗体喷在NC膜的T线、C线位置（位置如图所示），37℃烘箱中烘干2h备用。
图.试纸条结构图
2）结合垫的制备
以玻璃纤维RB65作为结合垫材料，用结合垫处理液浸湿，37℃烘箱中烘干4h备用。以1张大板的用量为例，取90ul保存在微球保存液中的荧光微球-aptamer标记抗体复合物，离心20分钟后弃上清，用微球复溶液超声重悬，用喷膜仪以100mm/s、3μL/cm的浓度喷于结合垫上，37℃烘箱中烘干3h备用。
3）样品垫制备
以玻璃纤维素SB06作为样品垫材料，用样品垫处理液浸湿，37℃烘箱中烘干4h备用。
4）吸水纸的剪切
剪好22mm×300cm的吸水纸，备用。
5）检测卡的组装
根据上述步骤制备的样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸依照图1所示的重叠关系将其依次贴在带有粘合剂的PVC底板；在自动斩切机中将粘贴好的检测板剪切成4mm宽的试纸条，装在塑料卡盒中，制成带结果观察窗和加样口的检测卡。
2.3时间分辨免疫荧光层析法检测膀胱癌细胞
1）待检测细胞准备
选用EJ人膀胱癌细胞系作为阳性细胞样本，HCV29和293两种种细胞系作为阴性细胞样本。分别将EJ、HCV29和293三种细胞培养至细胞浓度为106cell/ml，消化、离心收集，分别重悬在PBS缓冲液中，冰浴保存。
2）阳性细胞破膜悬液配制
选用悬浮EJ、HCV29和293三种细胞，浓度为107cell/ml，加入RIPA裂解液裂解细胞，分别将三种细胞破膜悬液稀释为104cell/ml。
3）阳性、阴性细胞破膜悬液检测
分别采用PBS缓冲液为0值对照，EJ、HCV29和293三种细胞破膜悬液（104cell/ml）作为阴阳性样本，共分为4组，每组5个样本各100μl，分别加入制备好的膀胱癌aptamer检测卡，层析15分钟后，用干式荧光检测仪检测。
4）阳性系列细胞破膜悬液检测
将EJ细胞破膜悬液分别稀释为105、104、103、102cell/ml，采用PBS缓冲液为0值对照，共分为5组，每组5个样本各100μl，分别加入制备好的膀胱癌aptamer检测卡，层析15分钟后，用干式荧光检测仪检测。
5）阳性病人尿液检测
取5个阳性病人（确诊膀胱癌）尿液，每个样本各50ml，离心5000rpm，20min，将上清液弃去，保留1ml底层溶液，分别重悬。5个样本各100μl，分别加入制备好的膀胱癌aptamer检测卡，层析15分钟后，用干式荧光检测仪检测。
四、分析和讨论
1.核酸适配体制备与优化
通过上述研究组摸索建立的实验步骤，获得特异性高和结合力强的膀胱癌表面抗原特异性aptamer，用于后续检测方法的建立。
2.阳性、阴性细胞破膜悬液检测
分别检测PBS（0值对照），EJ、HCV29和293三种细胞破膜悬液（104cell/ml），检测结果显示为检测线与质控线的比值，即T/C值，结果如下表
五、研究结论
通过制备膀胱癌表面抗原aptamer，掌握了配体指数富集法进化系统（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX）技术，熟悉了相关实验操作。建立了时间分辨免疫荧光层析膀胱癌aptamer检测方法，并用来检测。通过检测结果发现，该方法可以显著性、特异性地区分阳性细胞（EJ细胞）和阴性细胞（HCV29、293细胞）。初步检测发现，该方法检测数值与阳性细胞（EJ细胞）有浓度对应关系，阳性细胞检测灵敏度可达102cell/ml；将该方法应用于检测阳性病人的尿液，5个样本检测结果均为阳性。后续的研究，可针对aptamer性能筛选以及层析法配比，进行进一步优化，检测灵敏度可显著提高。
该检测方法简便易行，对仪器设备及检测环境无特殊要求，检测门槛较低，未来的应用前景非常广阔。
参考文献：
[1]TilkiD，BurgerM，DalbagniG，GrossmanHB，HakenbergOW，PalouJ，ReichO，RoupretM，ShariatSF，ZlottaAR.Urinemarkersfordetectionandsurveillanceofnon-muscle-invasivebladdercancer.Europeanurology，2011，60（3）：484-492.
[2]CzerniakB.Molecularpathologyandbiomarkersofbladdercancer.Cancerbiomarkers：sectionAofDiseasemarkers，2011，9（1-6）：159-176.
[3]EissaS，SwellamM，AminA，BalbaaME，YacoutGA，El-ZayatTM.Theclinicalrelevanceofurine-basedmarkersfordiagnosisofbladdercancer.MedOncol，2011，28（2）：513-518.
[4]KimMY，JeongS.InvitroselectionofRNAaptamerandspecifictargetingofErbB2inbreastcancercells.Nucleicacidtherapeutics，2011，21（3）：173-178.
[5]MedleyCD，BamrungsapS，TanW，SmithJE.Aptamer-conjugatednanoparticlesforcancercelldetection.Analyticalchemistry，2011，83（3）：727-734.
[6]WangZQ，ZhaoJ，ZengJ，WuKJ，ChenYL，WangXY，ChangLS，HeDL.Specificsurvivindualfluorescenceresonanceenergytransfermolecularbeaconsfordetectionofhumanbladdercancercells.ActapharmacologicaSinica，2011，32（12）：1522-1528.
[7]M.J.Maze，K.J.Sharples，K.J.Allan，M.P.Rubach，J.A.Crump.Diagnosticaccuracyofleptospirosiswhole-celllateralflowassays：asystematicreviewandmeta-analysis.ClinicalMicrobiologyandInfection，2019，25：437-444
[8]AiliangChen，ShumingYang.Replacingantibodieswithaptamersinlateralflowimmunoassay.BiosensorsandBioelectronics，2015，71：230-242.
[9]MayerG，AhmedMS，DolfA，EndlE，KnollePA，FamulokM.Fluorescence-activatedcellsortingforaptamerSELEXwithcellmixtures.Natureprotocols，2010，5（12）：1993-2004.
[10]HongjieXiong，JianhuaYan，ShundongCai，QunyeHe，DongmingPeng，ZhenbaoLiu，YanfeiLiu.Cancerproteinbiomarkerdiscoverybasedonnucleicacidaptamers.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules，2019，132：190-202
[11]ElifBurcuBahad?r，MustafaKemalSezgintürk.Lateralflowassays：Principles，designsandlabels.TrendsinAnalyticalChemistry，2016，82：286-306.
[12]ChenX，EstevezMC，ZhuZ，etal.Usingaptamer-conjugatedfluorescenceresonanceenergytransfernanoparticlesformultiplexedcancercellmonitoring.AnalChem，2009，81：7009-7014.
[13]Avci-AdaliM，PaulA，WilhelmN，etal.UpgradingSELEXtechnologybyusinglambdaexonucleasedigestionforsingle-strandedDNAgeneration.Molecules，2010，15：1-11.
[14]LazarDC，ChoEH，LuttgenMS，MetznerTJ，UsonML，TorreyM，GrossME，KuhnP.Cytometriccomparisonsbetweencirculatingtumorcellsfromprostatecancerpatientsandtheprostate-tumor-derivedLNCaPcellline.Physicalbiology，2012，9（1），016002.
[15]WendelM，BazhenovaL，BoshuizenR，KolatkarA，HonnattiM，ChoEH，MarrinucciD，SandhuA，PerriconeA，ThistlethwaiteP，BethelK，NievaJ，vandenHeuvelM，KuhnP.Fluidbiopsyforcirculatingtumorcellidentificationinpatientswithearly-andlate-stagenon-smallcelllungcancer：aglimpseintolungcancerbiology.Physicalbiology，2012，9（1），016005.
[16]HsiehYH，LiuSJ，ChenHW，LinYK，LiangKS，LaiLJ.Highlysensitiverarecelldetectionbasedonquantumdotprobefluorescenceanalysis.AnalBioanalChem，2010，396（3），1135-1141.