Foxp3，Fas，FasL，COMT基因多态性与汉族寻常型银屑病相关性分析

论文摘要

银屑病是一种反复发作,具有特征性鳞屑性红斑的慢性自身免疫性皮肤病,其发病率高、危害大、治疗困难。在自然人群中的发病率为0.1%-3%,我国约有300万患者,发病率有逐年上升的趋势,国际卫生组织将其列为影响人类健康的重要疾病。目前银屑病的发病机制尚不清楚,近十几年来,关于银屑病的病因和发病机制的研究主要集中于基因异常、免疫炎症机制、环境因素等方面。流行病学研究表明银屑病具有家族聚集性,是一种多基因遗传病。但任何单一因素均不能完全解释银屑病的发病机理,有学者认为多因素、多基因累积共同导致了银屑病的发生,不同的个体可能存在不同的病因组合,其中遗传基因的易感性占据了重要的地位。寻找与疾病相关的致病基因的方法大致可以分为两种:连锁分析和关联研究。关联研究主要以病例对照研究为基础,通过研究患者和正常对照的基因多态性位点基因型和等位基因频率的差异,从而判断该基因与疾病易感性的关系。近年来的研究表明皮肤角质形成细胞异常及自身免疫失衡相关的细胞和分子在银屑病的发病机制中具有重要作用,然而目前对基因多态性与银屑病易感性的关系少有研究。为此,本课题选择了四个与皮肤角质形成细胞异常及自身免疫紧密相关的基因作为研究重点,试图寻找其基因多态性和银屑病发病的相关性。Foxp3叉状头/翅膀状螺旋转录因子在外周T细胞中表达的精密控制对于维持免疫系统的内环境稳定具有重要意义。转录因子Foxp3可特异表达于胸腺和外周淋巴组织中天然的CD4+ CD25+调节性T细胞亚群上,可以认为Foxp3是CD4+CD25+调节性T细胞发育的调控机制中的重要开关。CD4+CD25+Treg细胞与效应性T细胞的免疫失衡,导致自身反应性T细胞的活化是银屑病免疫学发病机制的中心环节。目前已证实Foxp3基因突变同多种自身免疫性疾病的发生相关,而在银屑病这种自身免疫性皮肤病的发生中, Foxp3基因的变化是否通过调控CD4+CD25+Treg细胞直接或者间接发挥作用尚未得到证实。在本研究中我们探讨了Foxp3基因-6054 （deletion/ATT, rs5902434）位点、-3279 （A/C, rs376158）位点、-924 （A/G, rs2232365）位点和IVS9+459 （A/G, rs2280883）基因多态性与银屑病易感性的关系。Fas/FasL系统通过凋亡及致炎作用途径与银屑病的发生紧密联系。研究结果表明银屑病皮损组织中Fas、FasL的强表达是导致患者表皮角质形成细胞异常凋亡的机制之一。Fas、FasL的表达异常使T淋巴细胞异常凋亡,进而导致免疫耐受失控,成为自身免疫性疾病的机理之一。Fas/FasL信号通路的另一路径是诱导炎症因子,尤其是肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素8（IL-8）,该途径在表达抗凋亡分子如Bcl-xL水平较高的细胞中有明显优势。致炎的Fas信号通路通过活化的淋巴细胞介导银屑病的发生。国外已有研究证实Fas、FasL基因多态性与自身免疫性疾病的相关性,但Fas、FasL基因多态性与汉族银屑病患者的相关性目前未见报道。为此,我们对汉族银屑病患者和正常对照者进行Fas-1377、Fas-670、FASLG-844和FASLG-IVS2nt-124基因多态性检测,探讨其基因多态性在汉族人群中的分布及其与银屑病的相关性。儿茶酚邻位甲基转移酶（COMT）催化儿茶酚胺第3位羟基甲基化,是降解儿茶酚胺的主要代谢酶。文献表明COMT基因第4号外显子存在一个G>A点突变使158密码子从缬氨酸（Val）到蛋氨酸（Met）错义突变,导致COMT酶活性降低,神经末梢产生的儿茶酚胺类物质的增加可以直接损伤表皮细胞,同时不能阻止表皮细胞中毒物-o-醌的形成,诱发角质形成细胞氧化损伤,导致银屑病的发生和加重。有研究表明COMT-158（G>A）单核苷酸基因多态性与银屑病的发病有一定相关性。但目前COMT-158（G>A）单核苷酸基因多态性与汉族人群银屑病易感性的关系尚无研究。目的:分析Foxp3基因、Fas基因、FasL基因、COMT基因单核苷酸多态性与中国汉族人群银屑病发病的相关性,探讨银屑病的遗传学背景及发病机制。方法:对524例银屑病患者和549例正常对照抗凝血,抽提基因组DNA,使用PCR-RFLP和PCR-SSP方法分别检测Foxp3基因-6054 （deletion/ATT, rs5902434）、-3279 （A/C, rs376158）、-924 （A/G, rs2232365）和IVS9+459 （A/G, rs2280883）四个位点单核苷酸多态性。使用PCR-RFLP方法检测Fas-1377、Fas-670、FASLG-844和FASLG-IVS2nt-124四个位点基因单核苷酸多态性。使用PCR-SSP方法检测儿茶酚邻位甲基转移酶（COMT）基因第4外显子158密码子碱基单核苷酸多态性。对结果进行统计学分析,探讨Foxp3基因、Fas基因、FasLG基因、COMT基因单核苷酸多态性与中国汉族人群银屑病发病的相关性。结果:Foxp3-3279 AC （adjusted odds ratio [OR], 1.32; 95% CI, 1.01-1.74）和IVS9+459 GG（adjusted odds ratio [OR], 2.24; 95% CI, 1.41-3.58）基因型中国汉族银屑病的发病与发展存在相关性;Foxp3-3279变异联合基因型AC+AA显著增加男性人群（adjusted OR=1.60, 95% CI=1.11-2.31）罹患银屑病的危险性,同时与病情较重的银屑病发病（PASI score > 20）人群（adjusted OR=1.97, 95% CI=1.41-2.75）有显著相关性。IVS9+459变异联合基因型GA+GG与病情较重的银屑病发病（PASI score > 20）人群（adjusted OR=1.69, 95%CI=1.21-2.36）有显著相关性。Foxp3-6054位点ATT插入型等位基因频率在银屑病患者和正常对照组之间没有显著差异（32.1% vs. 29.3%, P = 0.174）。Foxp3-924位点G等位基因频率在银屑病患者和正常对照组之间亦无显著差异（42.6% vs. 40.0%, P = 0.238）。通过PCR-RFLP方法发现,所选择样本中Fas-1377位点A等位基因频率在银屑病患者和正常对照组之间没有显著差异（32.8% vs. 35.6%, P = 0.187）。Fas-670位点G等位基因频率在银屑病患者和正常对照组之间没有显著差异（37.2% vs. 39.1%, P = 0.389）。FASLG-844位点T等位基因频率在银屑病患者和正常对照组之间没有显著差异（26.5% vs. 23.4%, P = 0.100）。Fas-1377G/A和Fas -670A/G两点单倍体分析和单倍体联合分析结果发现,以没有突变的AG等位基因做为参照,GG与GA单倍体等位基因具有降低罹患银屑病危险性的趋势,AA单倍体等位基因降低罹患银屑病危险性的趋势具有统计学意义。联合分析发现以GA+AA/AA做为参照,其余三组GG/AA,GG/GG+GA, GA+AA/GG+AA显著降低罹患银屑病的危险性。通过PCR-SSP方法发现,COMT-158位点A等位基因频率在银屑病患者中无显著增高（24.7% vs. 23.7%, P = 0.624）。与COMT-158 GG基因型相比,-158GA （adjusted odds ratio [OR], 1.00; 95% CI, 0.78-1.29）和-158AA（adjusted OR, 1.23; 95% CI, 0.70-2.15）基因型不会增加罹患银屑病的危险性。联合基因型GA+AA与银屑病发病年龄和疾病严重程度之间均无显著相关性。结论:本研究首次分析了中国汉族人群中Foxp3、Fas、FasL、COMT基因单核苷酸多态性和单倍体基因型与银屑病发病的相关性,发现Foxp3-3279（A/C, rs376158）和IVS9+459 （A/G, rs2280883）位点基因多态性和汉族人寻常型银屑病发病相关,证实了Foxp3基因水平的变化与银屑病的关系,为研究汉族人群银屑病易感基因打下基础,也提示Foxp3可能会成为治疗银屑病的一个靶分子,为拓展银屑病的临床治疗途径提供基因学基础。Fas-1377、Fas-670、FASLG-844三个功能性多态性位点及COMT-158位点均未发现与银屑病易感性相关。Fas-1377G/A和Fas-670A/G两点单倍体分析和单倍体联合分析结果发现,GG与GA单倍体等位基因具有降低罹患银屑病危险性的趋势,AA单倍体等位基因降低罹患银屑病危险性的趋势具有统计学意义,合并基因型GG/AA,GG/GG+GA,GA+AA/GG+AA均显著降低罹患银屑病的危险性。此外,由于种族差异,仍有必要进行大样本量、不同种族的重复性研究。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 第一章 银屑病研究概况
• 第二章 单核苷酸多态性的研究进展
• 第三章 Foxp3基因,Fas and FasL基因和COMT基因与银屑病
• 正文
• 第一部分 样本资料的收集和基因组DNA抽提
• 1.主要试验设备、试剂和液体配方
• 2.调查表的设计以及条目定义
• 3.研究对象的选择与血液标本的采集
• 4.数据录入及统计分析
• 5.基因组 DNA 的制备
• 第二部分 FOXP3 基因多态性与银屑病易感性的相关性研究
• 1.实验方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第三部分 FAS 和 FASL基因多态性与银屑病易感性的相关性研究
• 1.实验方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第四部分 COMT-158 基因多态性与银屑病易感性的相关性研究
• 1.实验方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢