睾酮对小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症因子表达的影响及分子机制研究

论文摘要

第一部分:睾酮对RAW264.7巨噬细胞炎症因子表达的影响目的:多囊卵巢综合征持续低度炎症状态的形成机制不明,本研究以小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究对象,观察睾酮对巨噬细胞炎症因子表达的影响。方法:用生理浓度睾酮(10-9M)和高于生理浓度睾酮(10-7M、10-5M)分别处理细胞不同时间（睾酮处理组）,并以睾酮溶剂DMSO处理细胞作为对照组,观察睾酮对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）mRNA和细胞培养上清液中表达量的影响及睾酮作用的剂量效应和时间效应。结果:1.睾酮对RAW264.7巨噬细胞TNF-α和MCP-1 mRNA表达的影响:用生理浓度(10-9M)和高于生理浓度(10-7M)睾酮处理细胞6小时,TNF-α和MCP-1mRNA的表达均显著增加（均p＜0.01）;睾酮处理24小时,TNF-αmRNA的表达也显著高于对照组（均p＜0.05）,但低于6小时处理组（p＜0.01和p＜0.05）,MCP-1 mRNA的表达也高于对照组（均p＜0.05）,但与6小时处理组差异无统计学意义。2.睾酮对RAW264.7巨噬细胞TNF-α和MCP-1分泌的影响:（1）睾酮对RAW264.7巨噬细胞TNF-α和MCP-1分泌的时间效应:分别用睾酮溶剂DMSO（对照组）和生理浓度睾酮(10-9M)处理细胞0～24小时,发现睾酮处理12小时后TNF-α和MCP-1的分泌量较0小时显著增加（均p＜0.05）,但与对照组比较无显著差异（p＞0.05）。睾酮处理24小时后,TNF-α分泌量较对照组显著增加（分别为1331.8±26.43 pg/ml和893.0±73.23 pg/ml,p＜0.05）,MCP-1的分泌量也较对照组显著增加（分别为212.72±8.09 pg/ml和119.34±15.50 pg/ml,p＜0.05）。（2）睾酮对炎症因子分泌的剂量效应:分别用DMSO（对照组）、生理浓度(10-9M)和高于生理浓度(10-7M、10-5M)睾酮处理细胞24小时。与对照组比较,三种浓度睾酮处理组上清液中TNF-α和MCP-1的分泌量均显著增加（均p＜0.05）,高浓度(10-7M、10-5M)睾酮处理组细胞TNF-α的分泌量显著高于生理浓度(10-9M)睾酮处理组（p＜0.05、p＜0.01）;10-5M睾酮处理组MCP-1的分泌量低于10-7M睾酮处理组（p＜0.05）,TNF-α也低于10-7M睾酮处理组,但差异无统计学意义（p＞0.05）。结论:睾酮能促进小鼠RAW264.7巨噬细胞TNF-α和MCP-1表达,并表现出时间和剂量依赖效应。第二部分:睾酮促进RAW264.7巨噬细胞炎症因子表达的关键信号分子目的:在第一部分实验中,我们发现睾酮能促进RAW264.7巨噬细胞炎症因子的表达。本研究拟观察睾酮是否通过影响RAW264.7巨噬细胞的信号分子NF-κB和ERK1/2活性而促进炎症因子的表达。方法:我们采用第一部分实验结果中对RAW264.7巨噬细胞炎症因子表达影响最显著的睾酮浓度(10-7M)为本部分实验的睾酮处理浓度。1.睾酮处理细胞不同时间,用Western blotting方法检测NF-κB p65 Ser276和ERK1/2的磷酸化水平;2.用NF-κB抑制剂PDTC（100 uM,1小时）或MEK抑制剂PD98059（50 uM,2小时）处理细胞后,再用睾酮处理细胞1小时或30分钟,以单纯睾酮处理组作为对照,Western blotting方法检测NF-κB p65 Ser276和ERK1/2的磷酸化水平;3.用PDTC和/或PD98059处理细胞后,再用睾酮处理细胞6小时或24小时（PDTC和/或PD98059+睾酮组）,以睾酮溶剂作为空白对照,未加睾酮的PDTC和/或PD98059作为抑制剂对照;用RT-PCR和ELISA法检测细胞内TNF-α和MCP-1mRNA表达的变化和细胞培养上清液中分泌量的变化。结果:1.（1）随着睾酮处理时间的延长,NF-κB p65 Ser276的磷酸化显著增强:睾酮处理30分钟时磷酸化p65 Ser276的表达即显著增强（p＜0.05）,60分钟时表达量达峰值,为0分钟的2.49±0.40倍（p＜0.01）,6小时开始下降,但仍高于0分钟对照（p＜0.05）;（2）随着睾酮处理时间的延长,ERK1/2的磷酸化逐渐增强:30分钟时磷酸化ERK1/2的表达量为0分钟对照的4.05±0.32倍（p＜0.01）,2小时后表达下降,但仍显著高于0分钟对照（p＜0.05）。2.先用PDTC预处理细胞1小时再加睾酮处理1小时,磷酸化p65 Ser276的表达显著低于单纯睾酮处理组（p＜0.01）;先用PD98059预处理细胞2小时再加睾酮处理30分钟,磷酸化ERK1/2的表达显著低于单纯睾酮处理组（p＜0.01）。3.（1）PDTC+睾酮处理组TNF-α和MCP-1 mRNA的表达均显著低于单纯睾酮处理组（均p＜0.05）,但仍高于空白对照（均p＜0.05）;PDTC+睾酮处理组细胞培养上清液中TNF-α和MCP-1的量也显著低于单纯睾酮处理组,但仍高于空白对照组（均p＜0.05）;（2）PD98059+睾酮处理组TNF-α和MCP-1 mRNA的表达均显著低于单纯睾酮处理组（均p＜0.05）,但仍高于空白对照（均p＜0.05）;PD98059+睾酮处理组细胞培养上清液中TNF-α和MCP-1的量也显著低于单纯睾酮处理组,但仍高于对照组（均p＜0.05）;（3）PDTC+PD98059+睾酮处理组细胞TNF-α和MCP-1 mRNA的表达和上清液中的分泌量均显著低于单纯睾酮处理组（均p＜0.05）,而与对照组无显著差异（均p＞0.05）。结论:睾酮通过活化RAW264.7巨噬细胞NF-κB和ERK1/2信号通路而促进炎症因子TNF-α和MCP-1的表达。

论文目录

• 英文缩写及中英文对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 睾酮对RAW264.7巨噬细胞炎症因子表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 第二部分 睾酮促进RAW264.7巨噬细胞炎症因子表达的分子机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结与展望
• 综述
• 论文发表情况
• 致谢