四种葡萄组织培养体系的构建及卷叶病毒脱除与检测研究

论文摘要

葡萄卷叶病（Grapevine leafroll disease）是葡萄上的一种重要的病毒病,它分布最广泛造成的经济损失最大,而且也是病毒中唯一具有自然介体的病毒。进行病毒脱除处理、推广无毒化栽培对提高葡萄的生产具有重要的现实意义。本文以感病的代表品种美人指、优无核、红地球、红宝石无核四种湖南主栽的欧亚种葡萄品种为材料,研究GLRaV的脱除方法与RT-PCR检测技术。国内外学者对本试验所采用的试材以外的其它品种的病毒脱除多采取生物学或血清学方法检测其效果,检测结果多因植物体内病毒浓度低而出现假阴性的现象,得出错误的病毒脱除结论,故本试验对上述四个品种采用RT-PCR法检测脱毒处理后的组培苗,为生产应用提供可靠的指导。试验结果如下:1.建立了红宝石无核、红地球、美人指、优无核的组织培养体系,确定了葡萄茎段离体培养中外植体的最佳取材部位为当年生枝条的中下部,取材时间以9月10日左右为最佳;筛选出了四个品种的最佳初代、继代、生根培养基配方;组培苗生根后闭瓶炼苗6～8d,再敞口炼苗时间以6d为最好,有利于提高移栽成活率;为病毒脱除技术所需组培苗的准备和脱毒苗快繁奠定了基础。2.较系统研究了茎尖培养,热处理、低温结合茎尖培养,茎尖微体嫁接,病毒抑制剂的应用四种脱毒方法,初步认为热处理与茎尖培养相结合比单独茎尖培养成活率和脱毒率有明显提高,其中变温处理比恒温处理效果更好;4℃低温长期培养可以脱除葡萄卷叶病病毒,且操作简便易行,为行之有效的脱除植物病毒的新方法;茎尖嫁接也可以有效的脱除葡萄卷叶病病毒,嫁接后抗性增强,且移栽定植后明显加快了营养生长速度;板蓝根对病毒具有良好的钝化作用,但对茎尖的生长发育有一定的影响。3.取脱毒处理后成活苗的叶片,采用微量提取法提取较纯的RNA,参照已报道的GLRaV基因序列设计合成引物,以提取的RNA为模板,合成cDNA并以cDNA为模板进行PCR扩增,得到GLRaV的特异片段为300bp,可取大量样品同时检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 葡萄病毒病研究进展
• 1.1.1 葡萄病毒病的危害及特点
• 1.1.2 葡萄病毒病的主要种类
• 1.1.3 我国葡萄病毒病研究存在的问题和发展趋势
• 1.2 葡萄组织培养与快繁研究研究进展
• 1.3 葡萄脱毒技术研究进展
• 1.3.1 茎尖组织培养脱毒
• 1.3.2 温度处理脱毒
• 1.3.3 病毒抑制剂的应用
• 1.3.4 微体嫁接脱毒
• 1.3.5 愈伤组织诱导培养脱毒
• 1.3.6 几种脱毒方法的综合应用
• 1.4 葡萄主要病毒的检测方法研究进展
• 1.4.1 生物学检测
• 1.4.2 光镜和电镜观察
• 1.4.3 血清学检测
• 1.4.4 分子生物学检测
• 1.5 研究的目的、意义及内容
• 1.5.1 研究的目的、意义
• 1.5.2 研究内容
• 2 葡萄组织培养体系的建立
• 2.1 供试材料
• 2.2 试验方法与设计
• 2.2.1 培养基的配制与培养条件
• 2.2.2 外植体的准备
• 2.2.3 茎段初代培养
• 2.2.4 继代和增殖培养
• 2.2.5 生根与壮苗培养
• 2.2.6 炼苗和移栽
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 茎段初代培养
• 2.3.2 继代和增殖培养
• 2.3.3 生根培养
• 2.3.4 炼苗与移栽
• 2.4 讨论
• 2.4.1 不同培养基在葡萄组织培养体系中的作用
• 2.4.2 植物生长调节剂的影响
• 2.4.3 驯化、老化和玻璃化
• 2.5 小结
• 3 葡萄卷叶病毒的脱除技术研究
• 3.1 供试材料
• 3.2 试验方法与设计
• 3.2.1 茎尖培养脱毒
• 3.2.2 热处理、低温结合茎尖培养脱毒
• 3.2.3 茎尖微体嫁接脱毒
• 3.2.4 病毒抑制剂的应用
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 茎尖培养脱毒
• 3.3.2 热处理、低温结合茎尖培养脱毒
• 3.3.3 茎尖微体嫁接脱毒
• 3.3.4 病毒抑制剂的应用
• 3.4 讨论
• 3.4.1 关于茎尖培养
• 3.4.2 关于温度与茎尖培养
• 3.4.3 不同的嫁接方式与嫁接成活率
• 3.4.4 关于病毒抑制剂
• 3.5 小结
• 4 葡萄主要病毒的RT-PCR检测
• 4.1 供试材料与试剂
• 4.1.1 供试材料
• 4.1.2 供试试剂
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 葡萄叶片总RNA提取
• 4.2.2 总RNA含量、纯度和完整性测定
• 4.2.3 RT-PCR法检测葡萄卷叶病毒
• 4.2.4 葡萄样品的带毒情况测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 总RNA提取方法的比较
• 4.3.2 总RNA含量、纯度和完整性测定
• 4.3.3 RT-PCR检测葡萄卷叶病毒
• 4.3.4 几种脱毒方法脱毒效果比较
• 4.4 讨论
• 4.4.1 总RNA的提取
• 4.4.2 RT-PCR检测
• 4.4.3 脱毒方法对脱毒率的影响
• 4.5 小结
• 5 结论
• 参考文献
• 缩略词表（Abbreviation）
• 图版及图版说明
• 致谢
• 作者简历