论文摘要
研究业已证实,B型钠尿肽（BNP）或其非活性的N末端前钠尿肽（NT-proBNP）是心衰时较好的心脏标志物[3],能反映心室容积扩大、心室超负荷和心脏功能有无损伤及损伤程度[4-7]。早在2000年“Heart”杂志在一篇名为“BNP:很快成为治疗心衰患者的常规措施”的编者社论中就明确认为脑钠肽或B型钠尿肽（brain natriuretic peptide, B-type natriuretic peptide; BNP）有助于诊断心衰,可作为心衰患者预后标志物,是一种新的监控心衰的方法。2002年,国际上已经公认脑钠肽前体,NT-proBNP,是测定心衰的一个划时代的具有特异性的标志物。2002年11月19日,FDA批准罗氏诊断试剂公司（Roche Diagnostics, Inc）开发的一种用于实验室帮助诊断充血性心力衰竭（congestive heart failure）新的Elecsys proBNP酶联免疫检测试剂盒上市。目前,国际上只有三家公司拥有此项技术,NT-proBNP作为一种良好的心肌标志物已经获得临床认可,正在逐步进入临床,国内仅有少数几个著名的三级甲等大医院如北京医院、解放军总医院开始使用进口的NT-proBNP检测试剂盒,但由于目前的相关检测试剂依赖进口,导致患者使用成本高。通过检索,国内尚未见到NT-proBNP检测试剂相关专利及试剂盒产品注册申报,因此,研发具有自主知识产权的NT-proBNP新型免疫检测方法,生产我国自己的NT-proBNP检测试剂盒,改变目前高端临床诊断试剂几乎完全依赖国外进口产品的状况,具有非常重要的社会效益和经济价值。主要的研究内容和结果:1.人NT-proBNP的高效原核表达及免疫学检测标准品的研究1.1 NT-proBNP高效表达基因的构建我们采用人工合成和桥连拼接PCR技术相结合的方式构建了能在大肠杆菌（E.coli BL21 DE3）中高效表达的人NT-proBNP基因。根据GENEBANK提供的BNP基因序列（CR54976）得到NT-proBNP编码序列为pro-BNP基因中编码第27-103个氨基酸的共228个碱基.将此序列递交于Graphical codon usage analyzer （http://guca.schoedl.del）分析发现该基因中有部分氨基酸编码的密码子在E.coli BL21中使用的频率较低。由于使用常规的逆转录PCR获得的NT-proBNP基因无法避免以上问题,最终可能导致构建的重组质粒无法在大肠杆菌中顺利表达。采用套叠PCR,根据其原理将改造的基因分成碱基数为40左右的序列分别合成,每一片段与前后序列均有部分重叠,这样片段间可以互为引物和模板最终得到全长基因,并实现了密码子偏嗜性改造。1.2人NT-proBNP的高效原核表达与纯化将进行了密码子偏嗜性改造后的NT-proBNP基因序列克隆入原核表达质粒pET32a和pET42a构建不同形式的NT-proBNP原核表达重组质粒;经1.0mmol/L IPTG 37℃诱导表达5h,pET32a-NT-proBNP和pET42a-NT-proBNP均在BL21中表达融合蛋白,分子量分别为30KD和40KD左右,表达量占菌体总蛋白的30 %以上。经鉴定表达蛋白破菌后主要在上清中,为可溶性表达。采用离子交换、HIS和GST亲和层析柱建立了NT-proBNP重组蛋白的纯化方法,所获纯化蛋白纯度90%-95%左右。1.3人NT-proBNP免疫学检测标准品的制备。对已获得的NT-proBNP重组蛋白采用组合多种纯化方案及EK（enterokinase;肠激酶）酶切技术建立了NT-proBNP检测标准品的纯化工艺,用Roche公司NT-proBNP检测试剂盒测定,与其它形式的NT-proBNP重组融合蛋白相比, NT-proBNP-83具有更好的免疫活性和稳定性,组合多种纯化方案及EK酶切技术,建立的纯化工艺制备的NT-proBNP-83经HPLC检测纯度达95%以上,适合用于NT-proBNP免疫学检测工作标准品。2.人NT-proBNP单克隆抗体的制备及鉴定利用纯化的NT-proBNP蛋白免疫原采用改良的免疫程序和杂交瘤技术,经历14细胞融合,从数十株阳性克隆中筛选出7株抗NT-proBNP的特异性单克隆抗体,经亚类鉴定其中有5株为适合应用于诊断试剂的IgG1,经免疫组化、ELISA、及Western等多种手段对所得特异性分析,结果显示所制备的单抗为NT-proBNP特异的。同时,采用表位在线分析及参考现有NT-proBNP免疫诊断试剂采用的表位,我们设计并合成了NT-proBNP分子三个表位的多肽而且将其与KHL交联。所合成多肽除了免疫动物制备相应的表位抗体外,并且可用于对所获抗体的表位初步鉴定,经鉴定5株IgG单抗有两株为相同表位抗NT-proBNP 24-35氨基酸表位的抗体,其余三株正在鉴定,由此可见,结合后续多肽获得的抗体,我们至少能制备出三个以上NT-proBNP表位的抗体,为NT-proBNP免疫诊断试剂的研发奠定最坚实的基础。3.人NT-proBNP免疫传感器检测的初步研究电化学免疫传感器由于其简便、快速、灵敏度高等特点而具有良好的应用前景。我们采用电沉积纳米金技术将筛选的单克隆抗体固定于电极表面初步建立了基于电化学免疫传感器,并用于人NT-proBNP的检测。通过循环伏安法（CV）和交流阻抗技术（EIS）考察了电极表面的电化学特性,并对该免疫传感器的性能进行了详细的研究。采用CV对人NT-proBNP进行检测,初步研究获得了良好的检测效果,基本建立了人NT-proBNP免疫传感器,用此传感器对临床血清样品的检测显示了较好的临床诊断的一致性,此研究为进一步改良并开发出临床应用型NT-proBNP免疫传感器奠定基础。