盐酸法舒地尔促进骨髓间充质干细胞修复全层皮肤缺损的实验研究

论文摘要

目的:观察骨髓间充质干细胞与Rho分子信号通路的阻断剂盐酸法舒地尔（HA1077）对全层皮肤缺损的修复作用。方法:（1）兔骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养、鉴定和向表皮细胞分化趋向的实验研究:抽取健康新西兰大耳白兔骨髓,采用直接贴壁法（全骨髓培养法）培养骨髓间充质干细胞,48h后首次更换培养基,弃去未贴壁的细胞,每隔2-3天换液1次,接近融和时按1:2或1:3比例传代培养,留取第3-5代备用;采用免疫组织化学和流式细胞仪对所培养细胞进行鉴定。扩增培养3代后以70%完全培养基+30%成纤维细胞培养基上清液+10 ng/LEGF诱导分化,倒置显微镜下观察细胞形态的变化,并于诱导后7d运用免疫组织化学方法检测CK19、β1的表达。（2）HA1077与骨髓间充质干细胞共同应用修复全层皮肤缺损的实验研究:①将18只Wistar大鼠背部左右两侧各置备一直径为2cm的圆形皮肤缺损,缺损深至皮下。随机分为六组每三只动物为一组,将5种不同剂量的HA1077（每个创面0.5ml）应用于皮肤缺损创面并设立一空白对照组,治疗后以创面面积的变化及组织学改变评价愈合质量。②取新西兰大耳白兔12只,随机分为六组:空白对照组（A组）、EGF对照组（B组）、MSCs治疗组（C组）、诱导细胞治疗组（D组）、MSCs+HA1077治疗组（E组）和诱导细胞+HA1077治疗组（F组）。在背部脊柱两侧1cm处由前至后制备6个直径为3cm的圆形皮肤缺损（每侧各3个）,深至皮下。创面按分组要求注射药品和细胞创面按分组要求注射药品:MSCs及诱导细胞（诱导细胞为经诱导培养基诱导分化7天后所收集的细胞）浓度均为2×106/ml,每个创面注射细胞悬液1ml;HA1077浓度根据前一实验结果选定,每一创面注射0.5ml。细胞悬液及药品均直接注射至受试动物创面组织内。于伤后第3、7、14d用透明膜覆盖创面,并计算创面愈合指数,计算各组平均愈合时间。伤后3、7、14、21d按分组随机选择动物创面取创面组织行常规组织学（HE染色）检查。统计分析:本实验所有数据均以均数±标准差（ x±s）表示,采用SPSS统计分析软件进行方差分析及t检验。结果:（1）全骨髓培养48h后可见部分散在圆形贴壁细胞,5 d左右可见细胞集落,10 d后形成集落的数目、大小明显增加,细胞逐渐融合成片,培养至14d左右时细胞融合达80%-90%。传代后4h多数细胞贴壁变形,生长迅速,约7 d左右达完全融合,即可继续传代。细胞化学检测本实验分离、培养的细胞CD34（-）、CD44（+）、CD105（+）,可以证明所培养的细胞为较纯的MSCs,流式细胞结果进一步证实该结果。MSCs经诱导培养基诱导7d后可见细胞由原来的长梭形成纤维细胞状结构逐渐变短,细胞紧密排列成片,并可表达CK19、β1等标志。（2）①大鼠各组创面面积随伤后时间延长而逐渐缩小,其中以应用20μmol/LHA1077组创面缩小更为明显。②C、D、E、F四组在各检测时间点愈合指数均明显大于A、B两组（P<0.05）,其中E组、F组愈合指数又明显大于其它两治疗组（P<0.05）。E组和F组的平均愈合时间分别为17.25±1.29天和17.67±1.25也明显快于其他组别（P<0.05）,并且在皮肤愈合的病理结构上该两组也明显优于其他各组。但C组与D组之间、E组与F组之间无论愈合指数还是平均愈合时间均无显著性差异（P>0.05）。结论:（1）应用本实验方法,可以分离、纯化培养兔骨髓间充质干细胞,所培养的MSCs体外生长稳定、增殖速度快、可连续传代,可用于MSCs功能及应用的进一步研究。（2）MSCs在成纤维细胞培养上清液联合EGF的体外培养条件下有向表皮细胞诱导分化的趋向。（3）HA1077对MSCs修复全层皮肤缺损创面具有促进作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文 盐酸法舒地尔促进骨髓间充质干细胞修复全层皮肤缺损的实验研究
• 前言
• 第一部分 兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定和向表皮细胞分化趋向的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 第二部分 盐酸法舒地尔及骨髓间充质干细胞修复全层皮肤缺损的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 骨髓间充质干细胞及其在创面修复中的研究进展
• 致谢
• 个人简历