对金龟甲科、叶甲科害虫高毒力苏云金芽胞杆菌杀虫基因及工程菌的研究

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于杀虫基因编码的晶体蛋白。但是传统的Bt菌株存在杀虫谱窄、杀虫毒力有限等缺点,因此,必须通过生物技术等手段寻找新的基因资源,并且构建高效广谱的Bt工程菌来满足生产的需要。目前,发掘新的杀虫基因,研究其晶体蛋白结构和作用机制都是国内外研究的热点,本论文围绕对鞘翅目害虫高毒力Bt基因的克隆、工程菌的构建、杀虫晶体蛋白杀虫特异性机理等方面进行了一系列的研究,主要结果如下:1、对蛴螬高杀虫活性cry8类基因的克隆:从自行筛选的菌株Bt145中克隆了cry8Ga2新基因,并获得正式命名。转化无晶体突变株HD-73-,构建了新的Bt工程菌株HD8G2,生物活性测定结果表明,工程菌株HD8G2与野生菌株均对鞘翅目害虫暗黑鳃金龟表现出杀虫活性,LC50分别为1.25×108 cfu/g和5.59×108 cfu/g。从自行筛选的菌株BtSU4中克隆了cry8Ha1和cry8Ia1新基因,并获得正式命名。转化无晶体突变株HD-73-,获得了两株新型Bt工程菌株HD8H和HD8I。室内生物活性测定结果表明,HD8H和HD8I都对暗黑鳃金龟幼虫有较高的杀虫活性,LC50分别为2.19×1010cfu/g和8.50×109 cfu/g,对鳞翅目害虫无杀虫活性;从HD8H提取的蛋白经胰凝乳蛋白酶活化后,对叶甲科害虫大猿叶甲表现出较高的杀虫活性,LC50为18.00μg/ml。通过RT-PCR以及Western杂交证实cry8Ha1和cry8Ia1基因在宿主菌株BtSU4中均能正常的表达。两个新基因分别申请了国家发明专利,为其应用奠定了基础。2、对鞘翅目金龟甲科和叶甲科害虫工程菌的构建:将对鞘翅目叶甲科害虫高毒力的cry3Aa7基因,通过电击转化到对蛴螬高毒力的野生菌株BtSU4和HBF-1中,得到工程菌株3A-SU4和3A-HBF。室内生物活性测定结果表明,两株工程菌不仅对蛴螬表现出较高毒力,而且还获得对叶甲科害虫的杀虫活性。工程菌3A-SU4对马铃薯甲虫、大猿叶甲和暗黑鳃金龟幼虫的LC50分别为2.62μg/ml、1.25μg/ml和3.60×108 cfu/g;3A-HBF对马铃薯甲虫、大猿叶甲和铜绿丽金龟幼虫的LC50分别为1.74μg/ml,1.10μg/ml和0.73×108 cfu/g,两株工程菌扩大了对鞘翅目害虫的杀虫谱,具有良好的开发和应用前景。3、Cry8类蛋白杀虫特异性机理的研究:从蛋白的结构、蛋白的活化、蛋白与昆虫体内受体的结合三个方面进行Cry8类蛋白杀虫特异性机理的初步探索。通过结构域互换的方法,得到Cry8Ca2和Cry8Ea1两种蛋白不同结构域组合的8种杂合蛋白,分析8种杂合蛋白对蛴螬的杀虫活性与其结构的对应关系,其中工程菌株HD （3+15（）含由Cry8C的DomainⅠ和DomainⅡ及Cry8E的LoopⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因）、HD （7+11） （含由Cry8E的DomainⅠ和DomainⅡ及Cry8C的LoopⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因）、HD （6+10）（含由Cry8E的DomainⅠ和LoopⅠ及Cry8C的DomainⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因）在浓度为1010 cfu /g时,对铜绿丽金龟幼虫的较正死亡率分别为44%、36%和32%。但所有的杂合蛋白都对暗黑鳃金龟幼虫失去了杀虫活性。通过Cry8Ha1、Cry8Ia1、Cry8Ga1和Cry8Ga2四种蛋白被暗黑鳃金龟中肠液与胰凝乳蛋白酶消化,胰凝乳蛋白酶活化的Cry8Ha1蛋白对大猿叶甲幼虫有较高的杀虫活性,而活化的Cry8Ga1、Cry8Ga2和Cry8Ia1蛋白对大猿叶甲幼虫无杀虫活性。用生物素标记的Cry8Ha1和Cry8Ia1蛋白均能与暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟幼虫的BBMV结合,但是这两种蛋白仅对前者具有杀虫活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图和附表
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
• 1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫毒素
• 1.2 苏云金芽胞杆菌Cry 类杀虫晶体蛋白
• 1.2.1 Bt 杀虫晶体蛋白及其分类
• 1.2.2 对地下害虫蛴螬有杀虫活性的基因
• 1.3 Cry 类杀虫晶体蛋白结构与功能之间的关系
• 1.3.1 Cry 类杀虫晶体蛋白结构
• 1.3.2 Cry 类杀虫晶体蛋白结构与功能的关系
• 1.4 Cry 杀虫晶体蛋白的作用方式
• 1.4.1 作用模型
• 1.4.2 原毒素溶解与活化
• 1.4.3 与受体结合
• 1.5 苏云金芽胞杆菌的应用
• 1.5.1 转基因微生物
• 1.5.2 转杀虫cry 基因植物
• 1.6 转基因生物的安全性
• 1.7 本论文研究的目的与意义
• 第二章 Bt145 菌株中cry8 类基因的克隆
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基与抗生素
• 2.1.3 酶与生化试剂
• 2.1.4 常用溶液与缓冲液
• 2.1.5 供试昆虫
• 2.1.6 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Bt145 菌株形态观察
• 2.2.2 Bt145 菌株生长曲线测定及蛋白检测
• 2.2.3 Bt145 菌株的大质粒提取
• 2.2.4 Bt145 菌株cry 基因的 PCR-RFLP
• 2.2.5 cry8 类基因的克隆与表达
• 2.2.6 大肠杆菌JM110 热击感受态细胞制备与热击转化
• 2.2.7 大肠杆菌SCS110 电击感受态细胞制备与电击转化
• 2.2.8 大肠杆菌中质粒的提取
• 2.2.9 Bt 电击感受态细胞的制备与电击转化
• 2.2.10 阳性转化子的筛选
• 2.2.11 序列测定及分析
• 2.2.12 cry8 类新基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中的表达
• 2.2.13 生测菌株粉剂的制备
• 2.2.14 Bt 菌株杀虫活性的测定
• 2.2.15 数据处理
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Bt145 菌株生物学特性的研究
• 2.3.2 Bt145 的生长曲线与菌株蛋白表达
• 2.3.3 Bt145 的大质粒图谱
• 2.3.4 Bt145 菌株中杀虫晶体蛋白基因的PCR-RFLP 鉴定
• 2.3.5 Bt145 菌株中新型cry8 类基因的克隆与表达
• 2.3.6 克隆的cry8 类新基因的序列及分析
• 2.3.7 cry8Ga2 基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中的表达
• 2.3.8 cry8Ga2 基因杀虫活性的研究
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 BtSU4 菌株中cry8 类基因的克隆
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 其它材料
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 cry8 类基因的克隆
• 3.2.2 cry8 类基因的Bt 表达载体的构建
• 3.2.3 Bt 菌株蛋白的提取
• 3.2.4 Bt 蛋白的消化
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 BtSU4 菌体形态特征观察
• 3.3.2 Bt 菌株生长曲线测定
• 3.3.3 BtSU4 菌株的大质粒图谱分析
• 3.3.4 BtSU4 菌株中杀虫晶体蛋白基因的PCR-RFLP
• 3.3.5 BtSU4 菌株中新型cry8 类基因的克隆
• 3.3.6 cry8 类基因序列测定及分析
• 3.3.7 BtSU4 菌株中新型cry8 类基因的表达研究
• 3.3.8 Cry8 蛋白的消化
• 3.3.9 BtSU4 野生菌株和重组菌株HD8H 和HD81 杀虫活性的研究
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 第四章 cry 基因在宿主菌 BtSU4 菌株中的表达分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株与引物
• 4.1.2 培养基与抗生素
• 4.1.3 酶与生化试剂
• 4.1.4 常用溶液与缓冲液
• 4.1.5 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 RNA 的提取与纯化
• 4.2.2 RT-PCR
• 4.2.3 Cry8Ha1 和Cry8Ia1 蛋白的提取与纯化
• 4.2.4 抗体的制备与纯化
• 4.2.5 SDS-PAGE 及Western 杂交
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 cry8Ha1 和cry8Ia1 基因在BtSU4 菌株中的转录分析
• 4.3.2 Cry8Ia1 蛋白的纯化及抗体的制备
• 4.3.3 cry8Ia1 基因在BtSU4 菌株中的表达情况
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 对鞘翅目害虫高毒力工程菌的构建
• 5.1 材料与试剂
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 供试昆虫
• 5.1.3 酶与试剂
• 5.1.4 仪器设备
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 工程菌株3A-SU4 和3A-HBF 的构建
• 5.2.2 工程菌的扫描电镜检测
• 5.2.3 工程菌的SDS-PAGE 和Western blot 检测
• 5.2.4 工程菌中质粒的遗传稳定性
• 5.2.5 工程菌的生长情况观察
• 5.2.6 室内生物活性测定菌株粉剂的制备
• 5.2.7 工程菌株的生物活性测定
• 5.2.8 生测数据处理
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 工程菌的构建
• 5.3.2 晶体形态检测
• 5.3.3 工程菌株的SDS-PAGE 检测
• 5.3.4 工程菌的遗传稳定性
• 5.3.5 工程菌3A-SU4 和3A-HBF 的生长特性
• 5.3.6 工程菌株室内生物活性的测定
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 Cry8 类蛋白作用机理的研究
• 6.1 材料与试剂
• 6.1.1 菌株与质粒
• 6.1.2 引物对及扩增的片段
• 6.1.3 培养基与抗生素
• 6.1.4 酶与生化试剂
• 6.1.5 缓冲液
• 6.1.6 供试昆虫
• 6.1.7 主要仪器
• 6.2 研究方法
• 6.2.1 重叠PCR 获得杂合基因
• 6.2.2 杂合基因的PCR-RFLP 鉴定
• 6.2.3 杂合基因的克隆与表达
• 6.2.4 中肠液的提取与蛋白的消化实验
• 6.2.5 Cry8 类蛋白对胰凝乳蛋白酶稳定性及生物活性
• 6.2.6 BBMV 的制备
• 6.2.7 Bt 毒素的提取与纯化
• 6.2.8 Bt 毒素的生物素标记
• 6.2.9 Bt 毒素与昆虫BBMV 的体外结合实验
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 杂合基因的获取与鉴定
• 6.3.2 杂合基因的克隆
• -菌株中的表达'>6.3.3 杂合基因在HD-73^-菌株中的表达
• 6.3.4 杂合蛋白生物活性的测定
• 6.3.5 昆虫中肠液对Cry8 类蛋白的消化作用
• 6.3.6 Cry8 类蛋白对胰凝乳蛋白酶的稳定性实验
• 6.3.7 Cry 毒素的纯化与生物素标记
• 6.3.8 Cry 毒素与蛴螬BBMV 结合分析
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历