论文摘要
同种异体肾移植是终末期肾脏疾病（end stage renal disease, ESRD）最有效的替代治疗方式。移植肾急性排斥反应（acute renal allograft rejection, AR）是影响肾移植预后的重要因素,同时也是器官移植研究的热点。ABO血型系统属于人类主要组织相容性抗原系统（human major histocompatibility antigen systems, MHC）。ABO血型同型移植是目前公认的安全的器官选择方式,同时也是器官移植的基本技术规范,从理论到移植免疫的临床应用均很成熟。但是近年来有分散的文献报道ABO血型系统似乎是可以逾越的免疫障碍。因为这些文献没有充分阐述供受者ABO血型基因结构差异,所以未能被器官移植学界广泛接受。目前器官移植采用血清学方法鉴定ABO血型,近年来随着分子生物学技术的发展,分子生物学技术广泛应用到ABO血型研究领域,使得精确检测ABO血型基因结构成为可能。ABO血型基因位于人类第9号染色体短臂34.1-34.2区域,有7个外显子和6个内含子。ABO血型基因的碱基序列高度保守,ABO血型等位基因间仅有少数几个碱基差异。常见的A血型基因有A1血型等位基因和A2血型等位基因。A1血型等位基因和B血型基因之间仅有7个核苷酸差异,其中4个核苷酸差异导致血型基因转录翻译合成的氨基酸发生改变。A2血型等位基因与A1血型等位基因序列存在1个核苷酸差异（467C>T）,同时缺失1061位点的胞嘧啶（C）。O血型基因中最常见的血型等位基因是O1血型等位基因,其次是O2血型等位基因。O1血型等位基因与A1血型等位基因相比,O1血型等位基因缺失261位点的鸟嘌呤（G）。O2血型等位基因较为少见,与A1血型等位基因相比较,O2血型等位基因在261位点无鸟嘌呤（G）缺失,却存在3个核苷酸差异。ABO血型基因转录翻译表达糖基转移酶,这些糖基转移酶控制ABO血型抗原的生物合成。H转移酶催化糖蛋白前体物质末端半乳糖连接L-岩藻糖,从而产生H抗原。A血型和B血型人群分别表达UDP-N-乙酰-D-半乳糖胺（A转移酶）和UDP-D-半乳糖（B转移酶）,所以能够将N-乙酰半乳糖和半乳糖分别添加到H抗原的岩藻糖末端,产生A血型抗原和B血型抗原。AB血型人群同时表达UDP-N-乙酰-D-半乳糖胺（A转移酶）和UDP-D-半乳糖（B转移酶）,因此AB型红细胞表面同时表达A血型抗原和B血型抗原。O血型人群既不表达A转移酶也不表达B转移酶,故既不能合成A血型抗原,也不能合成B血型抗原。所以O血型人群红细胞表面仅表达H抗原物质。ABO血型基因位点突变可导致ABO血型基因转录翻译表达氨基酸的模板序列产生差异,使得ABO血型等位基因产物糖基转移酶的结构、活性及功能发生改变,从而产生ABO血型亚型。目前发现的A血型亚型有A1、A2、A3、Aw、Ax、Am&Ael等50余种,B血型亚型包括B3 （B301-306）, Bw, Bel, Bx等40余种,O血型亚型包括O1,O2等50余种。ABO血型中,最常见的A血型亚型是A1、A2亚型,在欧洲人种中A1亚型约占80%,A2亚型约占20%,A2血型中1～2%个体血清中可检测到抗A1抗体；最常见的O血型亚型是O1、O2亚型；目前关于B亚型的研究较少,本研究未对B型进行分型。常规应用血清学方法（正定和反定）鉴定ABO血型,但在鉴定ABO血型亚型及异常表达的个体时受到限制,而检测血型基因可精确分辨ABO血型亚型。目前检测ABO血型基因的常见方法有PCR-限制性内切酶酶切法（PCR-RFLP, polymerase chain reaction -restriction fragment length polymorphism）、引物特异性聚合酶链式反应（PCR-SSP, PCR amplification with sequence-specific primers）和PCR-DNA等检测技术。PCR-SSP检测ABO血型等位基因,是利用ABO血型等位基因位点特定碱基的差异设计扩增引物序列,设计合成的引物特异扩增目的基因。综上所述,随着分子生物学技术的不断发展,人类在ABO血型抗原、抗体、糖基转移酶、ABO血型基因各个层次的研究不断深入,所以我们认为有必要重新审视ABO血型这一经典问题在移植排斥中的意义,明确供受者ABO血型基因错配是否可导致移植术后排斥反应。本研究采用引物特异性聚合酶链式反应（PCR-SSP）技术检测87例肾移植受者及其对应48例供者的ABO血型基因,并探讨供受者ABO血型基因与移植肾急性排斥反应的相关性。本论文可分为以下两章。第一章PCR-SSP方法检测ABO血型基因的可行性分析目的：探讨应用引物特异性聚合酶链式反应（PCR-SSP）技术检测同种异体肾移植供受者ABO血型基因的可行性。方法：采用PCR-SSP技术检测2009年5月至2010年2月在我院行同种异体肾移植手术的87例肾移植受者及其对应的48例供者的ABO（A1、A2、B、O1、O2）血型基因。同时采用血清学方法确定其相应的血清学表型。结果：应用PCR-SSP方法在本组135个病例中检测到13种ABO血型基因型,其中A1A1血型基因型2例、A1O1血型基因型14例、A102血型基因型5例、A201血型基因型1例、A2O2血型基因型1例、BB血型基因型5例、BO1血型基因型14例、B02血型基因型7例、0101血型基因型22例、O102血型基因型41例、0202血型基因型9例、A1B血型基因型12例、A2B血型基因型2例,未检测到A1A2、A2A2血型基因型。血清学方法和PCR-SSP方法确定的ABO血型表型中,有A型23例,B型26例,O型72例,AB型14例。引物特异性聚合酶链式反应（PCR-SSP）方法和血清学方法确定的ABO血型表型完全一致。结论：本研究应用PCR-SSP方法和血清学方法所定ABO血型表型完全相符,提示本研究ABO血型等位基因引物设计合成可靠,引物扩增条件稳定。因为PCR-SSP方法检测ABO血型基因与HLA检测共享技术平台,且具有简捷、易操作、结果直观等优点,所以检测供受者HLA时同步检测供受者ABO血型基因具有很强的可行性。第二章ABO血型基因与移植肾急性排斥反应的关系目的：探讨供受者ABO血型基因与受者移植肾急性排斥反应（AR）的发生、治疗及转归的关系。方法：PCR-SSP方法检测2009年5月至2010年2月在我院行同种异体肾移植手术的87例肾移植受者及其对应的48例供者的ABO（A1、A2、B、O1、O2）血型基因,将受者分为供受者ABO血型基因相合组、供受者ABO血型基因错配组,分析供受者ABO血型基因相合组与错配组受者移植肾急性排斥反应的发生、治疗及转归情况。结果：本研究135例供受者中,供受者ABO血型基因相合组受者50例（占57.5%）,供受者ABO血型基因错配组受者37例（占42.5%）。供受者ABO血型基因相合组6例（占12.0%）受者发生移植肾急性排斥反应,ABO血型基因错配组11例（占29.7%）受者发生移植肾急性排斥反应。供受者ABO血型基因相合组与错配组受者间移植肾急性排斥反应发生率（12.0%VS29.7%,P=0.039<0.05）差异有统计学意义。经大剂量甲基强的松龙（MP）冲击治疗后,ABO血型基因相合组发生移植肾急性排斥反应的受者均临床逆转,移植肾功能恢复正常；ABO血型基因错配组发生移植肾急性排斥反应的受者,经甲基强的松龙（MP）冲击治疗后,10例受者临床逆转,1例受者周期性反复发生移植肾急性排斥反应。该受者同种异体肾移植术后3～10月间反复发生4次移植肾急性排斥反应,经大剂量甲基强的松龙（MP）冲击治疗有效,但甲基强的松龙治疗效果逐渐降低,术后1年血清肌酐（Scr）达441μmol/L供者和受者ABO血型基因分别为A1O1：A2O1,检测受者ABO血型同种抗体,患者血清中存在抗A1抗体,抗A1抗体效价IgG 1:64, IgM 1:16;随访复查患者血清群体反应性抗体（panel reactiveantibodies, PRA）阴性,自身免疫抗体阴性,他克莫司（FK506）血药浓度波动于7～10ng/ml,行移植肾动脉造影提示肾动脉未见明显异常。ABO血型基因相合组和错配组受者移植肾恢复时间（8.7±6.5 VS 7.6±4.9,P=0.105>0.05）、术后1个月血清肌酐（124.1±40.6 VS 122.5±39.4,P=0.849>0.05）、术后6个月血清肌酐（109.7±27.9 VS 118.8±47.6,P=0.532>0.05）差异无统计学意义。结论：供受者ABO血型基因错配组受者移植肾急性排斥发生率较ABO血型基因相合组受者的移植肾急性排斥发生率高。供受者ABO血型基因错配是导致肾移植受者发生移植肾急性排斥的危险因素。供受者ABO血型基因错配导致移植肾急性排斥的机制可能是通过ABO血型基因表达抗原诱发免疫反应引起移植肾急性排斥,也可能与供受者ABO血型基因错配直接相关。A2血型等位基因肾移植受者血清中抗A1抗体可导致A1表型供肾反复发生移植肾急性排斥并引起移植肾预后不良。临床实践中,A2血型等位基因受者接受O型供肾可提高移植的安全性。检测供受者ABO血型基因可预测和避免供受者ABO血型基因错配引起的移植肾急性排斥,并可结合供受者ABO血型基因为受者制定个体化免疫抑制治疗方案。我们建议在进行HLA定型同期对同种异体肾移植手术供受者进行ABO血型基因定型。