植物乳杆菌lp15-2-1转化合成共轭亚油酸的研究

论文摘要

共轭亚油酸（Conj ugated Linoleic Acid,简称CLA）是一系列含有共轭双键、具有位置和构象异构的十八碳二烯酸的总称,是必需脂肪酸亚油酸（Linoleic Acid.,简称LA）的一组异构体。CLA具有抗氧化、抗癌、抗动脉粥样硬化、减少机体脂肪等功能。本论文主要研究一株从泡菜中筛选获得的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）lp15-2-1转化LA为CLA的能力,并初步探讨了亚油酸异构酶（Linoleic acid isomerase,简称LAI）的酶学性质及定位,为后续深入研究和大规模工业化生产CLA提供试验依据。研究了植物乳杆菌1p15-2-1生长细胞转化LA合成CLA的反应条件。在单因素试验的基础上,采用响应面Box-Benhnken试验设计,建立初始pH值、培养温度和LA浓度的二次多项式回归方程模型,所得最佳参数：温度30℃,LA浓度0.21mg/mL,初始pH6.3,CLA实际产量为44.77μg/mL,转化率为21.32%,与优化前转化率7.78%相比,有了很大提高。研究了植物乳杆菌lp15-2-1静息细胞转化LA合成CLA的反应条件。在单因素试验的基础上,采用中心组合设计,建立培养温度、LA浓度、pH值、培养时间、细胞浓度的二次多项式回归方程模型,所得最佳参数：温度31℃,LA浓度3.8mg/mL,初始pH5.7,培养时间84h,细胞浓度32%, CLA实际产量为354.58μg/mL,与优化前产量相比,有了很大提高。研究了不同细胞破碎方式对植物乳杆菌1p15-2-1产CLA的影响,初步探讨了LAI的酶学性质,测得LAI的最适反应温度为30℃、最适pH值为5.5,该酶在弱酸性条件下活性较高。并对该菌株LAI的定位情况进行了研究,差速离心试验结果表明LAI是膜酶,即结合在细胞膜上的酶,而去垢剂Trtion X-100的试验效果不显著。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 微生物转化合成共轭亚油酸的研究概况
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 底物种类
• 1.1.3 底物浓度
• 1.2 共轭亚油酸的生理功能
• 1.2.1 抑制肿瘤
• 1.2.2 降血脂
• 1.2.3 免疫调节
• 1.3 共轭亚油酸的生物合成法
• 1.3.1 生长细胞转化法
• 1.3.2 静息细胞转化法
• 1.3.3 固定化细胞转化法
• 1.3.4 酶法生物转化法
• 1.4 亚油酸异构酶的研究进展
• 1.4.1 亚油酸异构酶的基本性质
• 1.4.2 亚油酸异构酶合成的影响因素
• 1.4.3 亚油酸异构酶的定位
• 1.4.3.1 胞内酶
• 1.4.3.2 膜酶
• 1.5 微生物合成共轭亚油酸
• 1.5.1 亚油酸对微生物细胞的毒害
• 1.5.2 共轭亚油酸在瘤胃中的合成
• 1.5.3 共轭亚油酸的体外合成
• 1.5.3.1 以亚油酸为底物
• 1.5.3.2 以蓖麻油酸为底物
• 1.6 本论文研究目的及内容
• 1.6.1 研究目的
• 1.6.2 研究内容
• 第二章 植物乳杆菌LP15-2-1生长细胞产共轭亚油酸条件优化
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 菌种活化
• 2.2.2 生长细胞培养法
• 2.2.3 试验设计
• 2.2.3.1 植物乳杆菌的生长特性
• 2.2.3.2 单因素试验
• 2.2.3.3 响应面试验设计
• 2.2.4 测定方法
• 2.2.4.1 共轭亚油酸标准曲线的绘制
• 2.2.4.2 共轭亚油酸样品的检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1. 植物乳杆菌的生长特性
• 2.3.1.1 温度对植物乳杆菌生长的影响
• 2.3.1.2 pH值对植物乳杆菌生长的影响
• 2.3.2 单因素试验
• 2.3.2.1 接种量对共轭亚油酸产量的影响
• 2.3.2.2 氮气排氧对共轭亚油酸产量的影响
• 2.3.2.3 振荡培养对共轭亚油酸产量的影响
• 2.3.2.4 培养温度对共轭亚油酸产量的影响
• 2.3.2.5 乳化剂对共轭亚油酸产量的影响
• 2.3.2.6 培养时间对共轭亚油酸产量的影响
• 2.3.2.7 培养基初始pH值对共轭亚油酸产量的影响
• 2.3.2.8 亚油酸浓度对共轭亚油酸产量的影响
• 2.3.2.9 亚油酸添加时间对共轭亚油酸产量的影响
• 2.3.3 响应面试验
• 2.3.3.1 回归方程的检验与优化
• 2.3.3.2 响应面分析图
• 2.3.3.3 最优工艺条件
• 2.4 本章小结
• 第三章 植物乳杆菌LP15-2-1静息细胞产共轭亚油酸条件优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 静息细胞培养法
• 3.2.1.1 菌体的培养和收集
• 3.2.1.2 静息细胞产共轭亚油酸的培养
• 3.2.2 试验设计
• 3.2.2.1 单因素试验
• 3.2.2.2 中心组合试验设计
• 3.2.3 测定方法
• 3.2.3.1 共轭亚油酸标准曲线的绘制
• 3.2.3.2 共轭亚油酸样品的检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 单因素试验
• 3.3.1.1 预培养条件对共轭亚油酸产量的影响
• 3.3.1.2 不同转速对共轭亚油酸产量的影响
• 3.3.1.3 超声破碎对共轭亚油酸产量的影响
• 3.3.1.4 氮气排氧对共轭亚油酸产量的影响
• 3.3.1.5 贮存条件对共轭亚油酸产量的影响
• 3.3.1.6 缓冲液pH值对共轭亚油酸产量的影响
• 3.3.1.7 缓冲液浓度对共轭亚油酸产量的影响
• 3.3.1.8 细胞浓度对共轭亚油酸产量的影响
• 3.3.1.9 亚油酸浓度对共轭亚油酸产量的影响
• 3.3.1.10 培养时间对共轭亚油酸产量的影响
• 3.3.1.11 培养温度对共轭亚油酸产量的影响
• 3.3.2 中心组合试验设计
• 3.3.2.1 回归方程的检验与优化
• 3.3.2.2 响应面分析图
• 3.3.2.3 最优工艺条件
• 3.4 本章小结
• 第四章 亚油酸异构酶的分离纯化及定位研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 亚油酸异构酶的分离纯化
• 4.2.1.1 菌体的培养和收集
• 4.2.1.2 细胞破碎
• 4.2.1.3 硫酸铵分级沉淀
• 4.2.1.4 酶液的透析脱盐
• 4.2.1.5 酶活测定
• 4.2.2 亚油酸异构酶的酶学性质
• 4.2.2.1 温度对亚油酸异构酶酶活的影响
• 4.2.2.2 pH值对亚油酸异构酶酶活的影响
• 4.2.2.3 乳化剂对亚油酸异构酶酶活的影响
• 4.2.3 亚油酸异构酶的定位
• 4.2.3.1 差速离心法
• 4.2.3.2 去垢剂法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 亚油酸异构酶的分离纯化
• 4.3.1.1 不同破碎方式对亚油酸异构酶酶活的影响
• 4.3.1.2 硫酸铵分级沉淀
• 4.3.2 亚油酸异构酶的酶学性质
• 4.3.2.1 乳化剂对亚油酸异构酶酶活的影响
• 4.3.2.2 温度对亚油酸异构酶酶活的影响
• 4.3.2.3 pH值对亚油酸异构酶酶活的影响
• 4.3.3 亚油酸异构酶的定位研究
• 4.3.3.1 差速离心法
• 4.3.3.2 去垢剂法
• 4.4 本章小结
• 第五章 总结与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 硕士期间主要学术成果