嗜虫书虱和嗜卷书虱AChE的分离纯化及其生化毒理学特性研究

论文摘要

本学位论文在国家自然科学基金（30871631）和教育部博士点基金（20080635009）的资助下,以危害严重的储藏物害虫嗜虫书虱Liposcelis entomophila和嗜卷书虱L. bostrychophila为研究对象,采用亲和层析法分离纯化了两种书虱体内的乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase,AChE）,并系统比较了嗜虫书虱和嗜卷书虱不同地理种群AChE生化毒理学特性的差异。主要研究结果如下：1嗜虫书虱和嗜卷书虱不同地理种群AChE的纯化采用普鲁卡因胺Procainamide亲和层析法纯化了嗜虫书虱和嗜卷书虱不同地理种群体内的AChE。其中,嗜虫书虱四川广汉种群AChE的纯化倍数最高（786倍）,湖北武汉种群AChE次之（700倍）,重庆北碚种群AChE纯化倍数最低（587倍）；广汉、武汉和北碚种群AChE的回收率分别为48.8%、29.8%和61.4%。嗜卷书虱重庆北碚种群AChE纯化倍数为497倍,回收率为61.2%；四川绵阳种群AChE纯化倍数为616倍,回收率为48%。纯化产物经SDS-PAGE检测,其纯度达到电泳级。嗜虫书虱和嗜卷书虱AChE蛋白分子量分别为55 kD和56 kD。2嗜虫书虱和嗜卷书虱不同地理种群AChE生化毒理学特性研究2.1嗜虫书虱AChE生化毒理学特性研究对纯化后AChE酶促反应的最适pH值和最适温度研究发现,嗜虫书虱3个地理种群AChE活性均在pH=7.0时最高。经模型拟合,3个地理种群AChE理论最适pH分别为：北碚种群AChE 7.36、广汉种群AChE 7.21、武汉种群AChE 7.22;嗜虫书虱3个地理种群AChE活性均在温度37.0℃时最高。经模型拟合理论最适温度分别为：北碚种群AChE 37.3℃、广汉种群AChE 38.℃、武汉种群AChE 39.2℃。采用药膜法测定了嗜虫书虱不同地理种群对马拉硫磷、氧乐果、涕灭威和残杀威四种药剂的敏感性差异。比较嗜虫书虱不同地理种群AChE生化及毒理学特性发现,嗜虫书虱3个地理种群的AChE动力学常数存在显著性差异,其中广汉种群AChE的Km和Vmax值均高于北碚和武汉种群,说明嗜虫书虱广汉种群的AChE对底物ATChI的亲和力最低,但对底物的水解催化活性最高。离体抑制作用结果表明,5种抑制剂（毒扁豆碱、BW284C51、残杀威、涕灭威和氧乐果）对嗜虫书虱不同种群AChE均有明显的抑制作用。比较双分子速率常数Ki值发现,毒扁豆碱对嗜虫书虱AChE的抑制作用最强,而氧乐果对AChE的抑制作用最弱。除氧乐果外,广汉种群AChE相比北碚和武汉种群AChE对抑制剂的抑制作用最不敏感。上述研究结果说明AChE可能介导了嗜虫书虱对常用杀虫剂的不敏感性,而且与湖北武汉、重庆北碚种群相比,嗜虫书虱四川广汉种群具有更大的抗性风险。2.2嗜卷书虱AChE生化毒理学特性研究对纯化后AChE酶促反应的最适pH值和最适温度研究发现,嗜卷书虱北碚和绵阳种群AChE在pH=7.0时活性达到峰值。经模型拟合,其理论最适pH值分别为：北碚种群AChE7.33、绵阳种群AChE 7.27。嗜卷书虱2个地理种群AChE活性均在37.0℃时最高,且经模型拟合其理论最适温度均为36.8℃。比较嗜卷书虱北碚和绵阳种群AChE生化及毒理学特性结果发现,北碚和绵阳种群AChE的动力学常数差异显著,其中绵阳种群AChE的Km和Vmax。值分别是北碚种群AChE的1.32倍和1.14倍,说明绵阳种群AChE对底物ATChI的亲和力较北碚种群AChE低,但对ATChI的水解活性高于北碚种群AChE。离体抑制作用结果表明,嗜卷书虱2个种群AChE对选用的6种抑制剂的敏感性从高到低依次为：毒扁豆碱>乙基对氧磷>BW284C51>残杀威>涕灭威>氧乐果,且绵阳种群AChE的双分子速率常数Ki值均小于北碚种群AChE。综合来看,嗜虫书虱和嗜卷书虱不同地理种群AChE生化和毒理学特性差异的原因可能在于书虱不同地理种群AChE对药剂的敏感性不同以及各地施药水平的差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 蛋白质分离纯化的一般原则
• 2 蛋白质分离纯化的方法
• 3 影响蛋白质稳定的主要因素
• 3.1 温度对蛋白质稳定的影响
• 3.2 缓冲溶液对蛋白质稳定的影响
• 3.3 蛋白酶对蛋白质稳定的影响
• 3.4 机械搅拌和高压对蛋白质稳定的影响
• 4 保持蛋白质稳定的方法
• 4.1 优化操作条件
• 4.2 加入稳定剂
• 4.3 简化纯化步骤
• 4.4 新型分离技术的应用
• 5 昆虫乙酰胆碱酯酶分离纯化的研究进展
• 5.1 离子交换层析法
• 5.2 凝胶过滤层析法
• 5.3 亲和层析法
• 引言
• 第二章 书虱乙酰胆碱酯酶的分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 供试虫源
• 1.2 主要供试药剂及仪器
• 1.3 主要试剂配制
• 1.4 普鲁卡因胺Procainamide亲和层析柱的制备
• 1.5 不同pH值对AChE粗提效率的影响
• 1.6 AChE的纯化步骤
• 1.7 蛋白含量测定
• 1.8 AChE活性的测定
• 1.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2 结果与分析
• 2.1 嗜虫书虱AChE纯化结果与分析
• 2.2 嗜卷书虱AChE纯化结果与分析
• 3 讨论
• 第三章 书虱乙酰胆碱酯酶生化及毒理学特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试虫源
• 1.2 供试酶源
• 1.3 主要供试药剂及仪器
• 1.4 生物测定
• 1.5 AChE活性的测定
• 1.6 pH对纯化后AChE活性的影响
• 1.7 温度对纯化后AChE活性的影响
• m和V_max）的测定'>1.8 AChE动力学参数（K_m和V_max）的测定
• 1.9 AChE离体抑制作用的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 嗜虫书虱生物测定结果
• 2.2 嗜虫书虱纯化后AChE的生化特性
• 2.3 嗜卷书虱纯化后AChE的生化特性
• 3 讨论
• 第四章 主要结论与研究展望
• 1 主要结论
• 2 研究展望
• 参考文献
• 在读期间发表的论文
• 致谢