一、幽门螺杆菌诱导MKN 45细胞分泌IL-8及其与p38信号转导途径的关系（论文文献综述）
崔秀杰[1]（2021）在《致瘤微生物HPV和H.pylori调控mTOR信号通路介导恶性转化的机制》文中研究说明研究背景致瘤微生物（包括病毒或细菌）诱发的慢性感染是导致细胞增殖失控继而诱导恶性转化的重要因素。2012年世界卫生组织/国际癌症研究中心（WHO/IARC）的一项报告指出,世界上约17%癌症发生与某些肿瘤相关病毒或细菌的感染直接有关。研究已证实,高危型人乳头瘤病毒（High-risk Human papillomavirus,HPV）和幽门螺杆菌（Helicobacterpylori,H.pylori）是引发人类癌症的Ⅰ级致癌病原体（HPV和H.pylori占可以引发人类癌症的病原体比例分别为31.5%和22.0%）。宫颈鳞状上皮和胃粘膜上皮细胞的增殖紊乱和恶性转化是环境因子（外因）与宿主调控应答（内因）交互作用的结果。因此,解析HPV和H.pylori感染相关的炎癌转化机制是重要的科学问题,对于有效降低宫颈和胃相关恶性转化的发生具有重要意义。高危型HPV的持续性感染是宫颈癌的主要始动因素。HPV转化基因E6和E7在组织中持续表达,介导宿主肿瘤抑癌蛋白p53和退化视网膜母细胞瘤蛋白pRb的降解。此外,HPV感染可通过导致宿主基因的不稳定性增高、宿主基因甲基化模式改变、非编码RNA的失调等参与推进宫颈细胞恶性转化的过程。H.pylori定植于胃粘膜上皮细胞,可通过调控RUNX3、P53、E-cadherin和β-catenin等致瘤相关分子促进恶性转化,增加胃癌发生的风险。此外,H.pylori感染后其毒力因子CagA通过Ⅳ型分泌系统将肽聚糖注入胃粘膜上皮细胞,引发胃区域感染炎症微环境、刺激宿主遗传物质发生突变,是介导恶性转化的早期趋动力。探究HPV和H.pylori致病机制是早期识别和干预肿瘤的基础性研究工作。HPV和H.pylori感染可通过与宿主细胞中不同的模式识别受体以及信号通路相互作用诱导炎癌转化。HPV除了可以抑制p53和pRb基因表达外,还与主要的上游通路:生长因子受体、Notch受体、Ras和PI3KCA等相互作用激活和改变mTOR信号通路,刺激宿主细胞的存活和增殖,诱导感染细胞的恶性转化。H.pylori感染除了可通过刺激胃粘膜上皮释放细胞因子,还可通过识别NOD样受体、Notch受体和Toll样受体等多种模式识别受体活化NF-κB、Wnt、JNK和mTOR等信号通路,形成H.pylori促进炎性因子表达的正反馈环路,参与调节病原微生物感染的宿主免疫应答和炎症响应,介导非可控性炎症增加炎癌转化的风险。研究证据表明,HPV/H.p感染通过影响mTOR信号通路中的基因突变以及上游信号分子的激活导致mTOR通路活化,而该通路的激活可进一步导致遗传不稳定、增殖失控、凋亡抵抗和代谢特性改变,最终导致感染细胞的恶性转化。mTOR信号通路可能在HPV和H.pylori感染所诱导的恶性转化中发挥重要作用。因此,进一步探究HPV和H.pylori感染激活mTOR信号通路的分子机制以及该通路在HPV和H.pylori诱导恶性转化中的生物学作用,将有助于提高疾病的监测防控,为靶向治疗提供新思路。本研究目的在于:（一）解析HPV-16转化基因E7通过调控miR-106a激活mTOR介导宫颈癌发生发展的功能与机制。（二）解析H.pylori通过调控髓系分化标志基因MYADM激活mTOR介导胃恶性转化的机制。第一部分:HPV-16 E7上调miR-106a靶向LKB1激活mTOR信号通路调控宫颈鳞癌细胞的异常增殖与自噬高危型HPV-16感染与宫颈鳞癌关系最为密切,其转化基因E6和E7的持续表达是导致子宫颈恶性转化的主要病因。E6和E7分别通过降解抑癌因子p53和pRb,导致细胞增殖紊乱、诱导细胞转化。E6和E7还可通过上调转录因子调控宿主microRNAs（miRNAs）影响宿主基因表达,进而破坏细胞生长和生存机制的稳定,导致宫颈恶性转化甚至宫颈癌。miR-106a是miR-17家族的一员,在癌症发生发展中的作用似乎具有组织或细胞特异性。目前有关miR-106a在HPV相关宫颈癌,尤其HPV及其转化基因是否可以调控宿主miR-106a的表达尚不清楚。因此,研究miR-106a在HPV阳性宫颈癌中的作用及机制,对于揭示HPV致癌的分子调控机制,选择有效治疗靶点具有重要的价值。有文献报道mTOR（Mammaliantargetofrapamycin,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）的激活可能与HPV病毒感染相关。研究表明,宫颈癌中HPV-16 E7能够降低抑癌基因LKB1的表达,而LKB1是mTOR上游关键的节分子。多项研究包括我们课题组以往的研究已报道,LKB1/AMPK/mTOR信号通路在宫颈癌中的作用至关重要,抑癌因子LKB1通过激活其下游AMPK,负向调控mTOR,抑制细胞增殖、转化及迁移等。LKB1也能够通过调控PTEN影响PI3K/Akt/mTOR信号通路,抑制肿瘤进展。然而,在HPV阳性宫颈癌中miR-106a的作用如何,其分子机制是否与LKB1/AMPK/mTOR通路有关?高危HPV-16感染能否对宿主细胞miR-106a表达发挥调控作用?目前尚不清楚。研究目的1.探究miR-106a在HPV-16阳性宫颈鳞状细胞癌组织和细胞系中的表达以及临床意义。2.揭示miR-106a对宫颈癌细胞增殖与自噬的影响及其分子调控机制。3.探究HPV-16转化基因E7对miR-106a的调控作用及机制。方法与结果1.miR-106a在HPV-16阳性宫颈鳞癌组织高表达且与恶性临床病理特征相关。RT-qPCR结果显示,miR-106a在HPV-16阳性宫颈鳞癌组织样本中表达显着升高。ROC曲线显示,miR-106a可以较好地区分宫颈鳞癌组织与非肿瘤组织。miR-106a高表达与宫颈鳞癌的肿瘤直径、高级别FIGO分期、淋巴结转移等呈显着正相关,而与患者年龄和脉管入侵等参数没有明显的相关性;logistic多因素分析显示miR-106a高表达与肿瘤大小、淋巴结转移、淋巴管入侵等因素有关。提示miR-106a可能参与了宫颈癌的发生和发展。2.LKB1是miR-106a在HPV-16阳性宫颈癌中的新靶点。生物信息学网站预测交叉结果获得98个miR-106a的潜在靶基因,其中LKB1引起我们的关注。荧光素酶报告基因实验显示LKB1是miR-106a的直接靶点;RT-qPCR结果显示,与对照细胞HaCaT相比,宫颈癌细胞系（CaSki、SiHa和HeLa）中miR-106a表达升高,尤其在HPV-16阳性CaSki中升高最显着。RT-qPCR和Western blot结果表明,miR-106a可负向调控LKB1表达。RT-qPCR结果显示,LKB1在HPV-16阳性宫颈鳞癌组织样本中表达显着降低。Spearman相关性分析显示,LKB1与miR-106a表达高度负相关。临床病理学参数相关性分析显示,LKB1低表达与宫颈癌患者恶性病理学特征相关。以上结果显示,LKB1是miR-106a的直接靶点。3.miR-106a通过靶向LKB1促进宫颈癌CaSki细胞增殖。CCK-8、平板克隆和EdU实验结果显示,miR-106a显着促进宫颈癌CaSki细胞的增殖,而LKB1抑制宫颈癌细胞增殖;但在宫颈癌SiHa和HeLa细胞（两者均LKB1表达缺失）中miR-106a促进增殖作用较弱。在CaSki细胞中采用LKB1的rescue实验进一步验证,平板克隆和EdU结果均显示,LKB1可逆转miR-106a对宫颈癌细胞CaSki的促进增殖作用。以上实验证实miR-106a通过靶向LKB1促进宫颈癌CaSki细胞的增殖。4.miR-106a通过靶向LKB1负性调控HPV-16阳性宫颈癌细胞自噬。Western blot结果显示,miR-106a抑制宫颈癌细胞自噬,而LKB1促进宫颈癌细胞自噬;并且miR-106a可以抑制雷帕霉素、饥饿诱导的细胞自噬。但与CaSki细胞相比,在LKB1缺失的SiHa和HeLa细胞中,miR-106a对自噬相关蛋白的影响不明显。进一步LKB1的rescue实验证明,LKB1可以逆转miR-106a对细胞自噬的抑制作用。以上结果说明,miR-106a通过靶向LKB1抑制HPV-16相关宫颈癌的自噬。自噬流检测结果显示,miR-106a可以抑制CaSki细胞中自噬小体（黄色斑点）和自溶溶酶体（红色斑点）的数量,且miR-106a明显抑制了雷帕霉素和饥饿所诱发的自噬流,而LKB1促进宫颈癌细胞的自噬流。以上结果说明miR-106a抑制CaSki细胞自噬是通过靶向LKB1实现的。5.miR-106a通过靶向LKB1激活AMPK-mTOR信号通路。在HPV-16阳性CaSki细胞中,Western blot检测结果显示,miR-106a可以激活mTOR信号通路。LKB1的rescue实验显示,LKB1过表达减弱miR-106a对mTOR表达促进的作用;此外,敲低LKB1可部分逆转敲低miR-106a对mTOR水平的影响。说明在HPV-16阳性CaSki细胞中miR-106a通过靶向LKB1激活AMPK-mTOR信号通路。6.HPV-16 E7激活miR-106a的表达并调控其功能。RT-qPCR结果显示,在HPV-16 E7稳定表达细胞系RPE1-E7和HaCaT-E7中,miR-106a表达显着增加;使用干扰组合（siRNA198和siRNA209）分别选择性地敲低CaSki细胞中HPV-16E6E7和HPV-16E6,观察干扰E7对miR-106a的表达影响。结果显示,与CaSki-siE6细胞相比,miR-106a在CaSki-siE6E7细胞中的表达显着降低。说明敲低E7部分抑制了 miR-106a的表达。此外,RT-qPCR显示,在HPV-16 E7阳性的宫颈鳞癌组织中,miR-106a表达与E7表达呈正相关。RT-qPCR和Western blot结果显示,与空白载体（Vector）相比,上述两种E7-表达细胞中LKB1表达降低;然而,当E7细胞转染miR-106a抑制剂时,LKB1可部分恢复表达,说明E7通过激活miR-106a抑制LKB1表达。在E7表达细胞中,CCK-8细胞增殖活性明显高于空载体细胞。而转染miR-106a抑制剂后,E7细胞的细胞增殖率降低。说明HPV-16E7可以激活miR-106a的表达并调控其增殖功能。7.HPV-16 E7通过激活转录因子c-Jun上调miR-106a表达。RT-qPCR和Western blot结果显示,c-Jun在E7-表达的RPE1和HaCaT细胞中表达显着升高;CaSki敲低E7（采用的干扰组合策略同前）,c-Jun表达降低,敲低c-Jun后,miR-106a表达随之降低。c-Jun的rescue实验显示,c-Jun可以部分逆转E7敲低后引起的miR-106a表达降低。CHIP-PCR实验结果显示,c-Jun可以直接结合到miR-106a的启动子区调控miR-106a转录。以上实验结果证明,HPV-16 E7通过上调转录因子c-Jun表达促进宫颈癌中miR-106a的转录。结论和意义在本研究中,我们系统地讨论了 miR-106a在HPV-16阳性宫颈癌中的作用及其分子机制。miR-106a在HPV-16阳性宫颈鳞癌组织和细胞中高表达,而且与患者恶性病理学特征相关。研究发现抑癌基因LKB1是miR-106a的新靶点,miR-106a通过靶向抑制LKB1激活AMPK-mTOR信号通路促进宫颈癌细胞增殖抑制自噬进而发挥致癌作用。此外,HPV-16E7通过转录因子c-Jun可上调miR-106a的表达并促进细胞增殖功能。本研究为进一步阐明HPV-16致癌的分子机制,寻找HPV相关宫颈癌的治疗新靶点提供了新的实验依据。第二部分:H.pylori通过NF-κB上调MYADM激活mTOR信号通路介导胃恶性转化幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染引发的炎症是介导恶性转化的重要基础。H.pylori定植于胃粘膜上皮细胞通过上调NF-κB、AP-1和IRFs等转录因子,进一步诱导IL-1β、IL-8和TNF-α等炎癌跨越细胞因子产生,激活下游NF-κB、Wnt/β-Catenin、EGFR、FAK和mTOR等信号通路,形成H.pylori促进炎性因子表达的正反馈环路,增加炎癌转化风险。MYADM（Myeloid-associated differentiation marker,髓系相关分化标记基因）是近年来鉴定得到的一种在多能祖细胞中表达、并在髓系分化过程中上调的造血相关标记基因。相关研究显示,MYADM可编码蛋白酪氨酸激酶FAK亚家族,在多种炎症以及肿瘤中表达异常。例如,在非酒精性脂肪肝病从单纯性脂肪肝到脂肪变性、炎症和坏死再到肝硬化的演变过程中,MYADM的表达逐渐升高。MYADM在黑色素瘤、激素抵抗型前列腺癌以及结直肠癌等肿瘤中高表达且与肿瘤转移以及不良预后有关。然而,MYADM在胃部恶性转化中的表达变化和生物学功能,以及是否与H.p感染相关尚未有报道。研究表明,H.pylori感染可激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进胃上皮细胞增殖。然而,在H.pylori感染的胃粘膜上皮组织、细胞中MYADM的表达以及功能如何?H.pylori感染能否调控宿主细胞MYADM表达以及调控机制如何?下游分子机制是否与PI3K/Akt/mTOR通路有关?目前尚不清楚。研究目的1.探究MYADM在H.pylori感染相关恶性转化中的表达变化及其临床意义。2.探究H.pylori是否可以调控MYADM的表达以及其分子机制。3.揭示MYADM在胃恶性转化中的作用和分子机制。方法与结果1.MYADM在胃癌组织和细胞中表达上调。Oncomine、GEO、TCGA生物信息学分析发现,与正常组织相比,MYADM在胃癌中表达显着上调。RT-qPCR结果显示,与癌旁组织相比,胃癌组织中MYADM表达显着升高;与人慢性萎缩性胃炎组织相比,胃癌组织中MYADM表达明显升高;MYADM在胃癌细胞系中表达高于人永生化胃粘膜上皮细胞GSE-1;Western blot结果显示,与相对应癌旁组织样本相比,胃癌组织中MYADM蛋白表达明显升高。以上结果表明MYADM在胃癌组织和细胞中高表达。2.MYADM高表达与胃癌进展以及胃癌病人预后不良相关。IHC结果显示,MYADM表达随胃炎到胃癌进展过程呈现表达逐渐升高的趋势;与癌旁组织相比,MYADM在胃癌组织中表达明显升高。TCGA和GEO数据库（GSE15459、GSE62254、GSE15459,GSE62254 和 GSE22377）生存曲线分析结果表明,MYADM高表达的胃癌患者总生存期（OS）、无进展生存期（RFS）再次进展生存期（PPS）显着低于MYADM低表达患者。以上结果显示,MYADM高表达与胃炎到胃部恶性转化以及胃癌患者不良预后之间具有潜在关系。3.MYADM促进体内外胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移以及局部浸润能力。平板克隆、CCK-8和EdU结果显示,MYADM促进胃癌细胞增殖能力;Transwell小室和划痕实验表明,MYADM促进胃癌细胞体外的迁移、侵袭能力;Western blot结果显示,MYADM抑制胃癌细胞EMT过程。裸鼠皮下成瘤实验显示,与对照组Lv-shNC相比,Lv-shMYADM组裸鼠皮下成瘤生长速度明显慢于Lv-shNC组,瘤体较小、重量较轻;RT-qPCR结果显示MYADM在Lv-shMYADM组裸鼠瘤体表达显着低于Lv-shNC组。裸鼠尾静脉注射实验显示,与Lv-shNC组相比,Lv-shMYADM组裸鼠肺转移灶较少,荧光信号明显减弱;HE染色显示,在Lv-shNC组出现瘤体包膜破坏和局部浸润现象,部分肿瘤侵犯到瘤体周围肌肉组织。而Lv-shMYADM组裸鼠瘤体包膜完整,没有明显浸润情况;并且IHC结果显示MYADM和ki67蛋白在Lv-shMYADM组表达阳性率低于对照组。以上数据提示,MYADM与胃癌的异常增殖、迁移、侵袭相关,MYADM在体内可以促进胃癌细胞成瘤以及发生局部浸润、转移的能力。4.MYADM 激活 PI3K/Akt/mTOR 信号通路。Western blot 实验结果发现,敲低 MYADM 后,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K 和 p-4E-BP1 蛋白表达水平降低,PI3K、AKT、mTOR、p70S6K 和 4E-BP1总蛋白表达变化不明显;相反,过表达MYADM后,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K 和 p-4E-BP1 蛋白表达水平升高,PI3K、AKT、mTOR、p70S6K和4E-BP1总蛋白表达变化不明显。以上结果显示,MYADM可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路影响胃癌细胞功能。5.幽门螺杆菌感染上调MYADM表达。RT-qPCR和Western blot检测发现,以不同浓度幽门螺杆菌（Hp11637和26695）分别感染GES-1、AGS和MKN-45细胞不同时间,结果显示MYADM在H.pylori感染后表达升高,并且具有感染的浓度和剂量依赖性。RT-qPCR、IHC检测发现,H.pylori阳性临床胃炎组织中MYADM表达显着高于H.pylori阴性胃炎组织。在幽门螺杆菌SS1单独/联合MNU灌胃小鼠模型中,发现H.pylori SS1单独/联合MNU感染组小鼠MYADM表达高于未感染组。以上结果显示,MYADM可能在H.pylori感染可以上调MYADM表达。6.幽门螺杆菌通过NF-κB信号通路激活转录因子c-Jun诱导MYADM表达。PROMO和JASPAR预测调控MYADM的转录因子c-Jun;双荧光素酶报告基因、CHIP-PCR结果表明,c-Jun可以结合到靶基因MYADM启动子区,MYADM是c-Jun直接靶点;RT-qPCR和Western blot结果证明,c-Jun可以正向调控MYADM表达。H.pylori感染GES-1、AGS和MKN-45细胞诱导的MYADM表达上调,而敲低c-Jun可以部分抑制H.pylori感染诱导的MYADM表达上调。以上实验证明,c-Jun在H.pylori感染所介导的MYADM表达上调中起到不可或缺的作用。探究H.pylori上调c-Jun激活MYADM的分子机制,Western blot检测GES-1、AGS和MKN-45细胞中H.pylori相关信号通路抑制剂对MYADM表达的影响,结果显示NF-κB抑制剂Bay11-7082显着抑制H.pylori感染诱导的MYADM表达;RT-qPCR结果显示,Bay1 1-7082可以抑制H.pylori感染GES-1、AGS和MKN-45细胞诱导的MYADM表达上调;Western blot结果显示,加入Bayl1-7082后基本解除了H.pylori感染诱导的c-Jun和MYADM表达上调。以上结果证明,NF-κB信号通路是H.pylori感染后通过激活转录因子c-Jun诱导MYADM表达上调的重要途径。结论与意义在本研究中,我们系统地研究了 MYADM在H.pylori感染相关的恶性转化中的作用及分子机制。MYADM与H.pylori感染相关的胃恶性转化的演进过程相关,且MYADM在H.pylori阳性胃炎以及胃癌组织和细胞中高表达,与胃癌病人预后不良有关。研究发现,H.pylori通过激活NF-κB信号通路上调转录因子c-Jun表达促进MYADM转录,进而激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进胃癌细胞在体内外增殖、侵袭和转移的能力。说明MYADM可能是H.pylori相关胃恶性转化的潜在靶点。以上研究有助于阐明H.pylori致胃恶性转化的新机制,为制定有效的H.pylori相关胃疾病的早期诊断、治疗及发现新靶点提供实验依据。
王刚[2]（2021）在《TAK1稳定YAP在胃癌干细胞自我更新和肿瘤发生中的机制研究》文中指出背景:胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤,也是全世界癌症死亡的第三大主要原因。肿瘤干细胞是实体肿瘤中具有自我更新,分化和致瘤能力的一小部分癌细胞,负责肿瘤的发生进展、复发、转移以及对化疗和放疗的抵抗。目前研究证实了胃癌干细胞的存在,且与胃癌的发生发展、转移和耐药相关。这项研究的目的是评估转化生长因子β活化激酶1（TAK1）在胃癌干细胞的自我更新和肿瘤发生中的作用。方法:采用RT-q PCR,western bolt和免疫组化方法检测TAK1在胃癌中的表达。通过体内和体外多种细胞功能实验评估TAK1对胃癌细胞恶性表型的影响。通过条件培养法诱导MKN45和MGC803细胞系形成干细胞微球,通过微球形成和流式分析了解其自我更新能力。质谱分析、Co-IP分析和免疫荧光用于了解TAK1和YAP的结合,通过western blot了解上下游相关分子的蛋白表达水平。进一步通过体内和体外实验了解靶向TAK1对胃癌的治疗效果。结果:我们发现TAK1在GC组织中的表达水平显着高于癌旁组织,其可以在体内和体外促进胃癌的多种恶性表型,并促进胃癌干细胞的自我更新。从机制上讲,在胃癌干细胞中,TAK1以非激酶活性形式占据了YAP的Ser127残基位点,从而阻止其被上游LATS1/2的磷酸化降解,诱导YAP的核易位,促进下游转录因子SOX2和SOX9的表达,最终促进了干细胞自我更新的能力。而胃癌肿瘤微环境中的肿瘤相关成纤维细胞分泌的IL-6促进了TAK1的表达,进一步增强了其促进胃癌进展的能力,而靶向TAK1可以增加胃癌细胞的化疗敏感性。结论:TAK1可以调控胃癌干细胞的自我更新和肿瘤发生能力。靶向TAK1可能是胃癌临床干预的潜在治疗靶点。
程修强[3]（2020）在《DUSP14在胃癌中的临床意义及通过EMT促进侵袭转移的机制研究》文中研究指明背景胃癌是世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤,2018年全球新增病例超过100万例,其中以我国发病率最高,目前也是全球癌症死亡的第二大原因。双特异性磷酸酶（Dualspecificity Phosphatase,DUSPs）是一组与人类疾病相关的异质性酶,属于I类基于半胱氨酸的蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）基因超家族。DUSP家族被报道广泛参与乳腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌等多种肿瘤的发生发展、耐药等生物学过程。但目前为止,DUSP14与胃癌之间的关系尚未明确。目的本研究拟首先了解DUSP14在胃癌和癌旁组织中的m RNA和蛋白表达情况,从而进一步根据其免疫组化的表达水平,了解DUSP14的表达与患者临床病理信息和预后的关联性。其次,我们从细胞层面探讨DUSP14在胃癌细胞系中的表达水平及其对胃癌侵袭和转移能力的影响。再次,我们通过上皮间质转化相关标记物的检测,了解DUSP14在胃癌侵袭转移中可能涉及到的机制。以期了解DUSP14在胃癌发生发展中的作用。方法1.通过GEPIA在线数据库分析DUSP14在TCGA胃癌数据库中胃癌和癌旁组织的m RNA表达水平;使用含有75例术前诊断为胃癌的新鲜肿瘤标本和癌旁标本制作的组织芯片了解DUSP14在胃癌和癌旁组织的表达和细胞定位情况。2.通过Kaplan–Meier Plotter在线数据库对DUSP14在TCGA胃癌数据库中的预后价值进行评估。通过组织芯片的免疫组化染色评分进一步评估DUSP14与胃癌临床病理参数和预后的关系。3.通过Western Blot了解DUSP14在人类正常胃粘膜细胞系GES-1和胃癌细胞系MKN45,MGC803,AGS,HGC27中的表达水平。构建敲减DUSP14的胃癌细胞系MKN45和MGC803。而后通过划痕实验和Transwell实验,以了解DUSP14对胃癌细胞的侵袭和转移能力的影响。4.通过对shDUSP14和shNC检测了E钙黏蛋白、N钙黏蛋白的表达水平,以明确DUSP14对胃癌侵袭转移能力的影响是否与激活EMT通路有关。结果1.通过GEPIA在线数据库分析了胃癌的TCGA数据,结果表明DUSP14在408例胃癌中m RNA表达水平显着高于211例癌旁组织。在75例胃癌和癌旁组织的组织芯片中,有53例高表达,22例低表达。DUSP14在胃癌细胞中主要定位于细胞的胞核和胞浆,在胃癌癌旁组织中表达较少。2.通过Kaplan-Meier Plotter分析了胃癌的TCGA数据,结果表明DUSP14在448例胃癌患者中高表达,预后明显差于428例低表达胃癌患者,P=0.00028,差异有统计学意义。DUSP14高表达组患者的肿瘤分化低、淋巴结N2和N3分期、TNM分期III期和IV期的构成比均显着高于低表达组,差异有统计学意义。而与两组患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位和T分期无显着统计学差异。DUSP14高表达患者的总生存时间明显低于低表达患者（Log Rank=10.60,P<0.05）。单因素分析结果表明肿瘤低分化和未分化、TNM分期III期和IV期以及DUSP14高表达的患者预后较差,多因素分析结果表明DUSP14的高表达是胃癌患者预后差的独立危险因素。3.DUSP14在人类正常胃粘膜细胞系GES-1的表达水平显着低于MKN45,MGC803,AGS,HGC27胃癌细胞系。细胞划痕实验结果表明DUSP14显着促进了胃癌细胞的迁移能力。Transwell实验结果表明DUSP14也显着促进了胃癌细胞的侵袭能力。4.与空白对照组相比,在敲减DUSP14的胃癌细胞系中E钙黏蛋白表达水平明显增高,N-钙黏蛋白表达水平显着下降。表明DUSP14对胃癌侵袭转移能力可能与激活EMT通路有关。结论1.DUSP14在胃癌组织中高表达,且其高表达与肿瘤低分化和未分化、淋巴结N2和N3分期、TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期显着相关。2.DUSP14促进了胃癌的肿瘤进程,与患者不良总生存时间呈正相关,多因素分析显示DUSP14的高表达是胃癌患者预后差的独立危险因素。3.DUSP14通过EMT途径促进了胃癌侵袭和转移的表型,促进了肿瘤的生物学进程。
祁一凡[4]（2020）在《EBV相关胃癌细胞中EBV通过TRAF2和ERK信号通路下调COX-2的研究》文中研究表明目的:与爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus,EBV）相关的胃癌,即EB病毒相关胃癌（Epstein-Barr virus-associated gastric cancer,EBVaGC）约占胃癌的近10%,由于胃癌在世界范围内的高发病率和病死率,EBVaGC发病的绝对数高,每年新发病例在90000以上,因此对EBVaGC发生机制以及其相关基因的研究具有重要意义。然而,迄今为止在EBV相关肿瘤中尚未见EBV潜伏膜蛋白2A（EBV-encoded Latent Membrane Protein 2A,LMP2A）与环氧合酶2（cyclooxygenase-2,COX-2）之间相关性的研究报道。EBV编码的潜伏膜蛋白1（EBV-encoded Latent Membrane Protein 1,LMP1）在EBVaGC中是否与COX-2相互作用也需要进一步研究。方法:（1）采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）检测3种EBV阳性胃癌细胞系（GT38,GT39以及SNU719）和5种EBV阴性胃癌细胞系（SGC7901,BGC823,AGS,HGC27以及MKN45）中COX-2表达水平是否存在差异。（2）重亚硫酸氰盐测序（Bisulfite Genomic Sequense,BSP）检测EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中COX-2基因启动子区甲基化水平。（3）qRT-PCR方法检测靶向COX-2编码基因的几种microRNA的转录表达。（4）采用Western Blot方法检测EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中COX-2和TRAF2（Tumor necrosis factor receptor-related factor 2）蛋白表达水平。（5）以pcDNA3.1分别构建LMP1和LMP2A编码基因的重组表达质粒,分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,筛选出相应的细胞克隆,观察外源性LMP1和LMP2A表达对COX-2和TRAF2表达的影响。（6）采用小干扰RNA技术（Small Interfere,siRNA）分别靶向干扰EBV阳性胃癌细胞系GT38中LMP1和LMP2A编码基因的表达,观察两种蛋白表达沉默对COX-2和及TRAF2的影响。（7）在EBV阴性胃癌细胞系SGC7901中用采用两种不同序列的siRNA靶向作用TRAF2编码基因,观察干扰后TRAF2的蛋白表达选择干扰效果好的序列,以确保其对COX-2蛋白下调作用的准确性。（8）采用MEK抑制剂PD0325901和si-ERK1/2阻断EBV阴性胃癌细胞系SGC7901中ERK通路,检测分析p-ERK是否参与LMP1对COX-2的调控。（9）EBV能够激活PI3K/AKT通路,采用PI3K抑制剂LY294002阻断EBV阳性细胞系GT38中AKT通路,研究p-AKT在EBV对COX-2调控中的角色。（10）采用si-Fox O1干扰EBV阴性胃癌细胞系SGC7901中Fox O1的表达,检测COX-2 mRNA和蛋白表达的变化。结果:（1）COX-2在3种EBV阳性胃癌细胞系中m RNA转录表达水平明显低于5种EBV阴性胃癌细胞系（t=10.3,P=0.0005）。（2）EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中COX-2基因启动子区甲基化水平分别为4.12%和11.42%,统计学分析结果显示,EBV阳性胃癌细胞系中COX-2基因启动子区甲基化水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系（t=2.58,P=0.04）。（3）EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中COX-2蛋白表达具有明显差异,统计学分析结果显示,EBV阳性胃癌细胞系中COX-2蛋白表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系（t=6.075,P=0.0017）。（4）EBV阴性胃癌细胞系SGC7901中外源性LMP1或LMP2A表达染可显着降低COX-2和TRAF2蛋白表达水平;而干扰EBV阳性胃癌细胞系GT38中LMP1或LMP2A表达,则COX-2和TRAF2蛋白表达则有所恢复。（5）干扰EBV阴性胃癌细胞系SGC7901中TRAF2表达,可观察到COX-2蛋白表达的急剧下降。（6）此外,在AGS中过表达LMP1使得ERK激活减少（t=7.49,P=0.01）,使用MEK抑制剂及si-ERK1/2鉴定ERK的阻断下调了COX-2的蛋白表达（P<0.01）。（7）在GT38中使用了PI3K抑制剂LY294002后发现其下游的转录因子FoxO1以及COX-2的表达均有恢复,并且在SGC7901中抑制FoxO1则降低了COX-2的产生（t=3.68,P=0.02）,因此鉴定出Fox O1参与了p-AKT对COX-2的抑制作用。结论:（1）在EBV阳性胃癌细胞中,外源性LMP1和LMP2A表达可通过下调TRAF2抑制COX-2表达。（2）而p-ERK参与了LMP1对COX-2的抑制。（3）观察到EBVaGC细胞中可以通过激活AKT通路磷酸化FoxO1降低COX-2的转录。
马玉泽[5]（2020）在《CXCL8/FAK信号通路在胃癌细胞增殖、迁移及EMT中的作用》文中研究说明胃癌是一种发病率和死亡率都很高的恶性肿瘤。胃癌的发生发展受到遗传因素和环境因素的影响,其发病机制涉及多个异常的信号通路。CXCL8是一种多细胞来源的细胞因子,在多种恶性肿瘤细胞中高表达。CXCL8在肿瘤细胞中的过表达与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成及EMT有密切联系。黏着斑激酶FAK在癌症中高表达,通过调节癌细胞迁移和上皮间质转化来促进癌症的发生发展。本研究利用实验室保存的MKN45和敲除FAK基因的胃癌细胞系MKN45(MKN45-FAK-/-)进行转录组测序,经差异表达基因分析,发现CXCL8在FAK基因敲除细胞中表达显着下调。基于CXCL8和FAK均在肿瘤发生发展的过程中发挥着关键作用,我们以人胃癌细胞MKN45为主要研究对象,人胃癌细胞NUGC3和NCIN87为辅,通过FAK功能缺失、抑制和过表达的方式来探究胃癌细胞中FAK对CXCL8表达的调控作用;通过细胞增殖,克隆形成,细胞迁移及EMT实验来检测CXCL8对胃癌细胞的促癌作用及FAK信号通路在CXCL8诱导的胃癌细胞促增殖、迁移及EMT过程中的调控作用。第一部分:转录组测序分析及验证,（1）对MKN45及MKN45-FAK-/-细胞系进行转录组测序分析,发现在FAK敲除细胞系中共筛选到277个基因发生差异表达变化,其中94个基因上调,183个基因下调;通过GO功能分析,KEGG分析以及差异表达基因pathway分析,选择DEG中的CXCL8（**p<0.01）作为后续研究对象;（2）qPCR和ELISA验证转录组差异表达基因分析结果,发现在MKN45-FAK-/-中,CXCL8表达显着下调（**p<0.01）;（3）qPCR和Western blot检测抑制FAK信号通路对胃癌细胞CXCL8的表达影响,TAE226抑制FAK导致CXCL8的表达下调（**p<0.01,*p<0.05）;（4）qPCR和ELISA检测过表达FAK对CXCL8表达的影响,发现过表达FAK导致CXCL8的表达显着增高（**p<0.01,*p<0.05）。第二部分,检测CXCL8对胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移及发生EMT的促进作用,（1）Western blot检测三种胃癌细胞中CXCL8的受体CXCR1/2,在三种胃癌细胞中,均检测到了CXCR1,几乎检测不到CXCR2;（2）细胞增殖实验,克隆形成实验和迁移实验检测CXCL8对胃癌细胞的促癌作用,发现CXCL8可以促进胃癌细胞的增殖、克隆形成和迁移（**p<0.01,*p<0.05）;（3）Western blot检测CXCL8诱导胃癌细胞发生EMT的情况,发现E-cadherin下调（**p<0.01,*p<0.05）,N-cadherin上调（*p<0.05）,证明CXCL8促进胃癌细胞发生EMT。第三部分,检测FAK信号通路在CXCL8诱导胃癌细胞促增殖、迁移及EMT过程中的调控作用,（1）Western blot检测CXCL8对FAK通路的激活情况,发现CXCL8可以激活FAK（*p<0.05）;（2）TAE226抑制FAK的条件下,细胞增殖实验和细胞迁移实验检测CXCL8对胃癌细胞的增殖和迁移的促进作用,发现在抑制FAK后,CXCL8对胃癌细胞促进增殖迁移的能力降低（**p<0.01）;（3）Western blot检测在MKN45及FAK敲除细胞系中CXCL8诱导细胞发生EMT的作用,发现CXCL8对MKN45-FAK-/-诱导的EMT的发生较MKN45相比有所抑制。综上所述,在胃癌细胞中,FAK的缺失、活性抑制或者过表达对CXCL8的表达分泌起着正相关的调控作用;三种胃癌细胞中表达CXCL8的受体CXCR1;CXCL8对胃癌细胞具有促进增殖、迁移、克隆形成以及上皮间质转化的作用;外源添加CXCL8激活MKN45中的FAK,表明CXCL8可以激活胃癌细胞中的FAK信号通路;在抑制FAK活性的条件下,CXCL8促进MKN45的增殖、迁移以及EMT都有一定程度的下调。由此证明,可能存在CXCL8/FAK信号通路调节胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和EMT。CXCL8/FAK信号通路在胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移及EMT中的作用研究将为阐明胃癌的发病机制及诊断和治疗方法提供理论基础和技术支持。
张翼[6]（2020）在《紫云英苷诱导人胃癌细胞凋亡、周期阻滞及迁移抑制作用的分子机制研究》文中认为胃癌作为一种发病于胃窦部位上皮腺体细胞的恶性肿瘤,在世界范围内胃癌的流行病学特征主要表现为较高的发病率以及死亡率,早期病例确诊困难以及患者预后不良,对人们健康产生巨大威胁。而我国更是胃癌发病和死亡人数双高的中心区域,每年新增胃癌患者占全世界比例高达47.13%。目前临床上胃癌的治疗主要仍是沿用传统对胃部癌变部位进行手术切除,化放疗结合法以及针对酪氨酸或生长因子为靶标的靶向药物治疗,这些治疗方法普遍存在副作用大、靶向性差、价格高昂、易对患者造成二次创伤等缺点;此外临床应用的一线胃癌治疗药物由于具有较强的毒副作用,极大程度上限制了相关药物在临床方面的使用。所以,开发新型高疗效、低毒副作用的抗胃癌药物仍然是目前亟待解决的问题之一。针对胃癌治疗药物的开发其主体思路仍为抑制胃癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡及抑制癌细胞的转移。因此本项目旨在探讨紫云英苷对胃癌AGS细胞的生长增殖、诱导凋亡、细胞迁移的影响,并对紫云英苷作用的相关信号转导通路及ROS的内在关联进行深入研究。利用CCK-8比色法测定10种胃癌细胞及4种正常细胞在不同浓度及时间梯度下的细胞存活率。利用流式细胞术和蛋白质免疫印迹法检测胃癌AGS细胞周期分布和细胞周期相关蛋白表达情况。利用Hoechst/PI双荧光染色法观察细胞凋亡形态,流式细胞术及蛋白质免疫印迹法检测线粒体途径引发凋亡的蛋白变化情况。利用细胞划痕实验对胃癌细胞的迁移情况进行观察并计算相应的细胞迁移率。利用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关信号通路（p38、JNK、ERK、NF-κB）,细胞周期信号通路（Akt、p53、STAT3）以及细胞迁移信号通路（TGF-β/Smad）的蛋白表达情况,并且进一步对核转录因子NF-κB、STAT3的核内及胞质含量进行测定。通过ROS特异性荧光探针进行染色,测定其胞内含量;然后利用流式细胞术检测ROS与紫云英苷诱发的生物学活性的内在关联,并在基因及蛋白水平上说明ROS与凋亡及周期的关联性。紫云英苷对10种胃癌细胞均具有良好的杀伤作用,对正常肺部IMR-90、肾脏293T、肝脏L-02及胃GES-1细胞具有较低的毒性作用,并且与阳性对照药5-FU相比,紫云英苷对胃癌细胞具有更强的增殖抑制能力以及更低的毒副作用。紫云英苷通过上调CKI（p21及p27）的表达,使得Cyclin B1与CDK1/2的表达以及CDK/Cyclin的结合被显着抑制,导致胃癌AGS细胞发生G2/M期周期阻滞。紫云英苷通过上调线粒体膜蛋白Bad/Bcl-2比率,使线粒体膜的通透性上升,内容物渗出,线粒体膜的稳态平衡被破坏,从而使得下游的Caspase-3及其作用底物PARP受到剪切,从而导致胃癌AGS细胞通过线粒体途径发生凋亡。紫云英苷能够促进p-p53蛋白质的表达,抑制p-Akt和p-STAT3蛋白质的表达,此外受到抑制的Akt信号通路能够进一步抑制STAT3转录活性,使胃癌细胞发生周期阻滞。紫云英苷能够通过磷酸化抑制了 ERK信号通路,并激活了 p38和JNK信号通路,引起细胞质内κB-α（NF-κB结合蛋白）表达量上升,导致胞质及核内NF-κB的活性被抑制,从而引起胃癌细胞发生凋亡。紫云英苷通过促进抑制TGF-β1、Smad2/3、N-cadherin 和 Vinmentin 的表达,促进 E-cadherin 的表达抑制了胃癌细胞的迁移。紫云英苷通过其氧化还原活性,引起细胞内活性氧的蓄积,进而调控MAPK、Akt、p53、STAT3和NF-κB信号通路,从而参与调控细胞凋亡及周期。综上所述,紫云英苷通过上调细胞内ROS水平,激活了 MAPK信号通路进而抑制了下游NF-κB信号通路,使胃癌细胞通过线粒体途径发生凋亡;ROS的升高抑制了 Akt信号通路,激活了 p53信号通路,进而使其下游的STAT3转录因子活性受到抑制,使胃癌细胞发生G2/M期周期阻滞。此外紫云英苷通过下调TGF-β/Smad信号通路,阻滞了 EMT途径,从而使胃癌细胞的迁移受到抑制。
冯艳钰[7]（2020）在《黄豆黄素诱导人胃癌AGS细胞凋亡机制的研究》文中提出胃癌是一种常发生在人体消化系统上的恶性肿瘤,癌症发病率数据分析表明,每年胃癌新增病例约为100万人。其中,我国胃癌每年新确诊病例约占全球发病病例的百分之五十,对国民生命健康构成了严重危害。黄豆黄素（Glycitein）作为一类主要的非营养素组分普遍存在于大豆的种子、根、茎、叶及其他豆科植物中。黄豆黄素具有多种生物活性,因其表现了良好的活性而受到各国学者关注。但其防癌抗癌作用机制及有效浓度尚未明确。因此,本研究通过食品毒理学,分子生物学和细胞生物学等方法,以黄豆黄素作为研究对象,并以12种人胃癌细胞作为体外研究模型,从细胞及分子水平上,揭示黄豆黄素对胃癌细胞的毒性作用,对正常细胞的毒理作用,周期阻滞,诱导细胞凋亡信号传导途径及其潜在的分子作用机制,为研制治疗胃癌的功能因子和开发新型抗肿瘤功能型食品提供新的思路和理论依据。本实验利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法进行检测黄豆黄素对12种人胃癌细胞的杀伤作用以及对4种人正常细胞的毒理作用;通过Hochest 33342/PI双染色法、Annexin V-FITC/PI双染法、JC-1线粒体膜电位荧光染色法及流式细胞术检测黄豆黄素对人胃癌细胞的诱导凋亡作用;通过流式细胞术、蛋白免疫印迹法检测黄豆黄素对人胃癌细胞内DNA相对含量和细胞周期相关蛋白表达量的调控作用;黄豆黄素对人胃癌细胞内凋亡相关蛋白表达量的调控作用采用蛋白质免疫印迹法进行检测;运用蛋白质免疫印迹法测定黄豆黄素对人胃癌细胞内MAPK/NF-κB/STAT3信号通路蛋白表达量的影响及三者信号通路相互间调节作用;使用DCFH-DA活性氧荧光探针法、流式细胞术及蛋白质免疫印迹法测定黄豆黄素对人胃癌细胞内活性氧水平及信号通路蛋白量的影响。CCK-8实验结果表明,黄豆黄素能够降低12种人胃癌细胞存活率,且呈剂量依赖性。此外,黄豆黄素对人正常胃GES-1细胞、人正常肝QSG-7701细胞、人类正常肺IMR-90细胞和人类正常胚胎肾293-T细胞的杀伤作用均无明显的毒副作用,且明显低于阳性对照5-FU组。Hochest 33342/PI双染色法和Annexin V-FITC/PI双染法结果表明,黄豆黄素处理AGS细胞后,细胞凋亡形态变化明显且凋亡比例不断增加。JC-1线粒体膜电位荧光染色法结果显示,黄豆黄素使AGS细胞内线粒体膜电位下降,通透性增加。此外,黄豆黄素能够显着上调促凋亡蛋白Bax的蛋白表达量,减少抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达量,Caspase-3和PARP被活化,进而触发人胃癌AGS细胞内部凋亡途径。此外,黄豆黄素能够使得人胃癌AGS细胞阻滞在周期的G0/G1期,并伴随有cyclinD1、cyclinE、CDK2/4/6蛋白的表达量下降,P21、P27表达量上升。此外,DCFH-DA活性氧荧光探针法与蛋白免疫印迹法实验结果表明黄豆黄素能够有效上调AGS细胞内活性氧水平,从而增加AGS细胞中p-p38和p-JNK的蛋白表达量,下调p-ERK、NF-κB和p-STAT3蛋白表达量,致使人胃癌AGS细胞发生线粒体依赖凋亡。综合以上结果,黄豆黄素对12种人胃癌细胞具有杀伤作用,其具体作用机制可能是黄豆黄素通过增加人胃癌AGS细胞内活性氧的累积,激活MAPK信号通路,抑制下游STAT3和NF-κB信号通路,促使线粒体膜电位下降,改变凋亡相关蛋白表达量,激活Caspase凋亡级联反应,最终诱导人胃癌AGS细胞发生线粒体依赖性凋亡,本实验结果旨在为研制出一种安全有效的防治肿瘤功能因子提供新的思路和理论依据。
薛福敏[8]（2020）在《4.1B蛋白对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究》文中研究指明胃癌（Gastric cancer,GC）在全世界范围内都是一个发病率和致死率均较高的疾病,其中有接近一半的胃癌发生在中国。所以积极有效的治疗胃癌在我国是一个不容忽视的问题。关于胃癌的发病机制目前仍然不够清楚,目前关于胃癌的治疗手段主要包括内镜治疗、外科手术治疗、放化疗等。但是整体形势仍旧不容乐观,胃癌患者达到5年总生存率的仅有40%。所以我们急需要进一步明确胃癌的的发病机制和病理过程中的分子机制变化,才能够为治疗胃癌提供更加有效地治疗靶点。4.1蛋白亚家族包括4.1B、4.1R、4.1G、4.1N这四个成员,它们由4个同源基因序列编码。4.1蛋白亚家族成员均有3个高度保守的结构域:位于氨基端的FERM结构域（Four.1 protein,Ezrin,Radixin,Moesin）、血影蛋白和肌动蛋白结合结构域spectrin-actin-binding domain,SABD)以及羧基端结构域（carboxy-terminal domain,CTD）。其中FERM结构域是最大的保守结构域。4.1B（Erythrocyte membrane Protein Band 4.1 Like 3（EPB41L3））蛋白属于4.1蛋白亚家族的一员。在小鼠中,4.1B基因位于17号染色体;人4.1B基因位于染色体18p11.3。目前已经有许多研究发现在多种肿瘤组织中4.1B蛋白的表达出现减少或缺失。也有少量报道涉及4.1B蛋白与胃癌之间的关系;但这些报道并未详细阐述4.1B蛋白在胃癌进程中发挥的具体作用及内部机制。肿瘤细胞多具有异常增殖、迁移和侵袭能力增强等特性。本研究首先旨在探讨4.1B蛋白在胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭等肿瘤细胞特性方面所起的作用;然后进一步通过检测常见的与细胞增殖相关的EGFR/MAPK以及EGFR/PI3K/AKT通路了解4.1B蛋白抑制胃癌细胞增殖能力的具体机制。上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）是指极化的上皮细胞转变为具有间充质样表型的细胞。转变后的细胞其细胞间的粘附连接能力均下降,使细胞更易于迁移,从而使肿瘤细胞的特性更加明显。近些年许多研究表明病理状态下EMT与肿瘤的侵袭和转移有密切的关系。所以我们第四部分首先了解4.1B蛋白对于胃癌细胞粘附、迁移和侵袭等方面的影响,然后进一步观察EMT相关蛋白β-catenin、E-cadherin、MMP-2和MMP-9表达以了解4.1B蛋白影响胃癌细胞这些特性的具体分子机制。第一部分 4.1B蛋白在胃癌患者胃粘膜的表达及与患者预后的关系目的:胃癌是一种世界范围内发病率和致死率均较高的疾病。在癌症相关死亡中居于第二位,在世界肿瘤发病率中居于第四位。目前许多研究表明4.1B蛋白在各种肿瘤中的表达出现减少或者缺失,关于4.1B在胃癌患者胃粘膜中的表达也有少量研究,但是这些研究还不够详细和深入。本部分研究首先拟观察胃癌患者胃粘膜组织中4.1B蛋白的表达水平与正常癌旁对照有何差异;然后进一步拟观察4.1B蛋白的表达水平能否作为一个独立因素影响胃癌患者的预后（DFS和OS）。材料与方法:1.在郑州大学第五附属医院病理科选取2011年1月至2013年1月共计102例胃癌胃大切手术石蜡包埋标本。其中65岁以下49例,65岁以上53例。男性59例,女性43例。所有患者术前均未接受放化疗治疗。对应的癌旁对照组标本来自于距癌症部位至少大于5cm的正常胃粘膜,所有癌及癌旁正常胃粘膜均经HE染色及病理组织学诊断确诊。其中102例标本中,高分化病例仅有10例,中分化病例有34例,低分化或者未分化病例共计58例。本研究经郑州大学第五附属医院医学伦理委员会批准,患者或者家属均签署知情同意书。2.苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosinstaining,HE）染色所有胃癌组织标本及正常癌旁对照组标本切片,拟观察组织细胞的结构。3.免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）染色所有胃癌组织标本及正常癌旁对照组标本切片,拟观察胃癌组织及正常癌旁对照组4.1B蛋白水平是否与有差异;并且这种差异是否与胃癌的严重程度具有一定的相关性。4.按照IHC的结果,根据如下评分标准:采用10×40光学显微镜,随机选择至少10个不重复视野和100个细胞,观察胃癌胃大切患者胃黏膜的免疫组化切片,镜下根据胃粘膜细胞胞膜胞浆染色阳性计数判断,阳性细胞≤5%为0分,5%～25%为1分,25%～50%为2分,50%～75%为3分,>75%为4分。着色强度判断根据细胞膜和胞浆染色程度与阴性对照或者背景色对比,着色强度评分标准:未着色为0分,轻度着色为1分,中度着色为2分,重度着色为3分。以上两项得分之和4-7分为阳性,0-3分为阴性。将胃癌组和正常对照组按照4.1B蛋白表达的程度分成阴性和阳性。然后通过四格表配对x 2检验的方法先分析出胃癌组和正常对照组4.1B蛋白的表达量差异是否有统计学意义。5.如果胃癌组和正常对照组4.1B蛋白的表达差异有统计学意义,我们拟进一步应用x2检验两两比较方法,观察4.1B蛋白阳性组和阴性组之间各种临床指标差异是否有统计学意义。6.我们随访胃癌患者的生存期（DFS和OS）,通过Kaplan-Meier生存分析评估4.1B蛋白表达阳性和阴性胃癌患者的平均生存期差异。7.如果4.1B蛋白表达阳性组和阴性组胃癌患者的生存期（DFS和OS）存在差异,我们拟进一步通过单因素和多因素COX回归分析观察4.1B蛋白的表达量是否可以作为一个独立因素影响胃癌患者的生存期（DFS和OS）。结果:1.根据IHC和表1的结果我们发现正常对照组胃粘膜4.1B蛋白的表达量明显高于胃癌患者胃粘膜细胞的表达量（x2=32.23;P<0.001）,并且4.1B蛋白的表达水平与胃癌患者的病情轻重程度呈负相关。2.表2结果显示4.1B的表达水平与肿瘤体积、肿瘤分化程度、淋巴结转移数量、整个TNM分级均呈负相关（P<0.05）;而与患者的年龄、性别、幽门螺杆菌的感染、肿瘤的发生部位、WHO分级、血管侵袭、肿瘤侵袭的深度、神经转移等无明显相关性。3.通过Kaplan-Meier分析和log-rank test我们分析了患者的DFS和OS,结果发现4.1B表达阳性的患者5年DFS是22个月,而4.1B表达阴性的患者其5年DFS仅有15个月;而4.1B表达阳性患者的5年OS是51个月,而4.1B表达阴性患者5年OS仅有33个月。所以,我们可以得出结论:4.1B的表达水平影响胃癌患者的DFS和OS（P<0.001）。4.通过应用单因素和多因素COX回归分析分析了剩余95例胃癌胃大切手术切除术后患者的DFS和OS。结果发现单因素COX回归分析显示4.1B蛋白的表达水平、肿瘤的大小、淋巴结的转移（N0 vs.N1+N2+N3）和TNM分级（Ⅰ+Ⅱ vs.Ⅲ）是影响胃癌患者预后的因素。然后我们进一步通过多因素COX回归分析发现4.1B蛋白的表达水平、肿瘤的体积大小和总的TNM分级（Ⅰ+Ⅱ vs.Ⅲ）是影响胃癌患者DFS和OS的独立因素。结论:胃癌患者胃粘膜4.1B蛋白的表达水平与正常癌旁对照相比出现降低或者缺失,并且其表达水平与胃癌患者病情轻重程度呈负相关;4.1B蛋白的表达水平可以作为一个独立因素影响到胃癌患者的DFS和OS。第二部分 4.1B蛋白在胃癌细胞中的表达及与细胞增殖的关系目的:此部分我们打算观察两种胃癌细胞株MGC-803和MKN-45中4.1B蛋白的表达水平,以及4.1B蛋白对两种胃癌细胞株增殖能力的影响。然后通过在胃癌细胞株MGC-803细胞内过表达4.1B蛋白和敲除MKN-45胃癌细胞株的4.1B基因,再观察对这两种胃癌细胞株的增殖能力有何影响。最后通过裸鼠皮下荷瘤实验观察4.1B蛋白的表达在体内对于胃癌细胞株增殖能力的影响。进一步通过检测EGFR/MAPK通路和PI3K/AKT通路信号蛋白的变化,了解4.1B蛋白影响胃癌细胞增殖的内部机制。材料与方法:1.体外培养胃癌细胞株MGC-803和MKN-45,提取两种胃癌细胞株的总蛋白,然后通过western blotting技术检测两种胃癌细胞株4.1B蛋白的表达。2.将胃癌细胞株MGC-803和MKN-45按照0.5 × 106/孔种植在10cm直径培养皿中,每组设置三个复孔。然后分别在第3天、第5天、第7天进行细胞计数,每组至少计数三次,取其平均值。最后用GraphPad Prism 7以及SPSS20.0分析数据。3.过表达胃癌细胞株MGC-803 4.1B蛋白,然后通过流式细胞仪分选出4.1B-GFP转染成功的细胞,加入G418继续筛选培养。提取细胞总蛋白通过western blotting技术以及共聚焦显微镜确定目的细胞的比例达到90%以上。然后观察4.1B过表达组（4.1B-GFP）和对照组细胞（GFP-CON（4.1B-/-））增殖情况（具体步骤同2）。4.通过Crisper cas9技术敲除胃癌细胞株MKN-45 4.1B基因。加入嘌吟霉素筛选单克隆继续培养。提取细胞总蛋白应用western blotting技术明确敲除成功。然后观察4.1B敲除组（4.1B KO）和对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））细胞增殖变化（具体步骤同2）。5.选取5周龄Balb/c小鼠20只,每组5只分别皮下注射4.1B过表达组（4.1B-GFP）和对照组细胞（GFP-CON（4.1B-/-））的MGC-803细胞以及4.1B敲除组（4.1B KO）和对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））的MKN-45细胞。1周后肉眼可观察到皮下有瘤体形成。隔日一次用游标卡尺记录瘤体的长短径。按照公式体积=瘤体短径2×瘤体长径×0.5来计算瘤体体积。待到最长径接近20mm时处死裸鼠,完整剥离瘤体,然后尽快称重,拍照并准确记录数据。最后用GraphPad Prism 7以及SPSS20.0分析数据。6.取处于对数增殖期的4.1B过表达组（4.1B-GFP）和对照组细胞（GFP-CON（4.1B-/-））的MGC-803细胞,提取总蛋白,应用western blotting技术检测4.1B蛋白表达与否对于EGFR/MAPK以及PI3K/AKT信号通路蛋白的影响。7.取处于对数增殖期的4.1B敲除组（4.1B KO）和对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））的MKN-45细胞,提取总蛋白,应用western blotting技术检测4.1B蛋白表达与否对于EGFR/MAPK以及PI3K/AKT信号通路蛋白的影响。结果:1.通过western blotting技术发现胃癌细胞株MGC-803的4.1B蛋白表达缺失,而胃癌细胞株MKN-45细胞4.1B蛋白表达呈阳性。2.细胞增殖曲线发现4.1B蛋白表达阳性的MKN-45胃癌细胞株其细胞增殖能力较4.1B蛋白表达阴性的MGC-803细胞明显减慢,差异有统计学意义（P<0.05）。3.MGC-803胃癌细胞株过表达4.1B蛋白后发现,其增殖能力受到抑制（P<0.001）。而敲除MKN-45胃癌细胞株的4.1B基因后其增殖能力明显增加（P<0.001）。4.裸鼠荷瘤实验发现4.1B蛋白过表达后MGC-803（4.1B-GFP）裸鼠皮下成瘤的体积（P<0.05）和重量（P<0.001）均较阴性对照组MGC-803（4.1B-/-）明显下降,差异有统计学意义。而当MKN-45胃癌细胞株的4.1B基因被敲除（4.1BKO）以后,其裸鼠皮下成瘤体积（P<0.001）和重量（P<0.05）均较对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））明显增加,差异具有统计学意义。5.Western blotting结果显示4.1B过表达组（4.1B-GFP）与对照组细胞（GFP-CON（4.1B-/-））的MGC-803细胞相比,其p-ERK（P<0.01）、p-AKT（P<0.05）的蛋白表达水平下降,而总的ERK、AKT表达量无明显差异。总EGFR（P<0.01）以及磷酸化的EGFR（P<0.01）均减少。MAPK/JNK、MAPK/p38这两个通路的蛋白水平无差异。6.Western blotting结果显示4.1B敲除组（4.1B KO）和对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））的MKN-45细胞相比,其p-ERK（P<0.01）、p-AKT（P<0.01）的蛋白表达水平增加,而总的ERK、AKT表达量无明显差异。总EGFR（P<0.01）以及磷酸化的EGFR（P<0.001）均明显增加。MAPK/JNK、MAPK/p38这两个通路的蛋白水平亦无差异。结论:体内及体外实验显示4.1B蛋白能够通过EGFR/MAPK/ERK1/2以及EGFR/PI3K/AKT信号通路抑制胃癌细胞的增殖。第三部分 4.1B蛋白抑制肿瘤细胞增殖的机制目的:第一部分及第二部分的研究结果显示4.1B蛋白在胃癌患者和正常对照组胃粘膜细胞的表达存在差异;在增殖能力不同的胃癌细胞株MGC-803和MKN-45的表达量也有很大差异。并且我们通过裸鼠荷瘤实验也进一步验证4.1B蛋白的存在对胃癌细胞的增殖能力有一定的抑制作用,然后我们进一步通过western blotting结果发现4.1B蛋白对胃癌细胞的抑制作用是通过EGFR/MAPK/ERK1/2以及EGFR/PI3K/AKT通路实现的。但是我们发现4.1B蛋白的存在能够影响总的EGFR蛋白的水平,所以我们这一部分的目的是进一步探讨4.1B蛋白到底是如何影响到总的EGFR蛋白的水平的。材料与方法:1.使用野生型的和4.1B基因敲除的C57BL/6小鼠模型,在母鼠怀孕第13.5天时处死小鼠,取出胚胎,分离出小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）,体外处理使其永生化。然后观察野生型MEF细胞（4.1B+/+）和4.1B KO MEF细胞（4.1B-/-）的增殖情况,具体方法详见第二部分材料和方法。2.提取野生型MEF细胞（4.1B+/+）和4.1B KO MEF细胞（4.1B-/-）的总蛋白,使用western blotting方法检测4.1B基因敲除前后EGFR/MAPK以及PI3K/AKT信号通路蛋白的变化。3.加入EGFR抑制剂erlotinib通过细胞计数观察野生型MEF细胞（4.1B+/+）和4.1B KOMEF细胞（4.1B-/-）的增殖情况。进一步明确4.1B蛋白影响细胞增殖是否是通过EGFR通路起作用的。4.通过real-time PCR观察在MGC-803、MKN-45以及MEF细胞系中随着4.1B蛋白的变化EGFR在mRNA水平是否发生变化。以明确EGFR蛋白的变化与其合成有关还是与其降解有关。5.通过real-time PCR和western blotting技术观察MGC-803、MKN-45 以及MEF细胞系中随着4.1B蛋白的变化EGFR转录因子Sp1在mRNA水平和蛋白水平的变化。6.通过siRNA干扰Sp1在MKN-45（4.1B KO）以及MEF（4.1B KO）细胞中的合成,观察4.1B缺失的细胞中Sp1的确实能够下调EGFR的合成。以证明Sp1确实是EGFR合成的关键转录因子。7.通过细胞免疫荧光和蛋白免疫共沉淀技术观察4.1B蛋白与EGFR蛋白是否存在共定位和相互作用。8.设计EGFR胞内段各个多肽片段以及4.1B蛋白各个结构域,通过pull-down技术明确4.1B蛋白的哪个结构域与EGFR蛋白的哪个多肽片段相结合发挥抑制细胞增殖的作用。结果:1.4.1B KO MEF细胞（4.1B-/-）和野生型MEF细胞（4.1B+/+）相比,其增殖能力明显增加,差异有统计学意义（P<0.01）。2.野生型 MEF 细胞（4.1B+/+）和 4.1B KO MEF 细胞（4.1B-/-）的 western blotting结果与胃癌细胞株MGC-803和MKN-45相同,4.1B蛋白的变化也是通过影响EGFR/MAPK/ERK1/2和EGFR/PI3K/AKT通路发挥作用的。3.加入EGFR抑制剂erlotinib后,4.1B KO MEF细胞的增殖能力明显下降,接近野生型MEF细胞的增殖能力,提示4.1B蛋白发挥作用需要通过EGFR蛋白。4.Real-time PCR结果显示随着4.1B蛋白的变化EGFR在mRNA水平也随之发生相应的变化:4.1B蛋白表达组MGC-803（4.1B-GFP）（P<0.01）、MKN-45（4.1B+/+）（P<0.001）和野生型 MEF（P<0.05）三组细胞内 EGFR mRNA 水平均较4.1B缺失组明显下降,差异有统计学意义。5.Real-time PCR 和 western blotting 结果显示随着 4.1B 的变化,EGFR 转录因子Sp1也发生相应的变化。4.1B蛋白表达组MGC-803（4.1B-GFP）、MKN-45（4.1B+/+）和野生型MEF三组细胞内EGFR转录因子Sp1无论是在mRNA水平还是在蛋白水平与4.1 B缺失组相比均出现下降。6.siRNA干扰的结果显示干扰MKN-45（4.1B KO）以及MEF（4.1B KO）细胞中Sp1的合成以后,其EGFR蛋白的水平下降。这个结果足以证明转录因子Sp1是EGFR蛋白合成关键的转录因子,且4.1B影响细胞增殖必须通过这个通路发挥作用。7.细胞免疫荧光发现4.1B蛋白和EGFR蛋白在细胞上存在共定位,进一步的蛋白免疫共沉淀技术发现4.1B蛋白和EGFR蛋白存在相互作用。8.设计EGFR胞内段各个多肽片段以及4.1B蛋白各个结构域的pull-down结果明确显示4.1B蛋白的FERM结构域可以与EGFR蛋白胞内近膜端起始13位氨基酸（P13）（R644-R656）相结合来发挥调节细胞增殖的作用。结论:4.1B蛋白的FERM结构域通过与EGFR蛋白胞内近膜端起始13位氨基酸（P13）（R644-R656）相结合,进而抑制EGFR蛋白胞内近膜区（JM）的二聚化,抑制了EGFR的活化;EGFR活化减少通过下调MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT通路,进而下调了 EGFR转录因子Sp1的活化,造成总的EGFR蛋白含量减少,总的EGFR蛋白的减少其磷酸化水平必然也降低,所以就形成一个负反馈进而影响到细胞的增殖。第四部分 4.1B蛋白对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响及机制研究目的:前面三部分我们探讨了 4.1B蛋白对胃癌细胞增殖的抑制作用及内部机制,这部分我们拟观察4.1B蛋白对胃癌细胞迁移和侵袭的影响以及内部机制。材料与方法:1.通过细胞粘附实验观察4.1B过表达组（4.1B-GFP）和对照组细胞（GFP-CON（4.1B-/-））的 MGC-803 细胞以及 4.1B 敲除组（4.1B KO）和对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））的MKN-45细胞随着4.1B蛋白表达水平的变化,胃癌细胞粘附速度的变化。利用全自动多功能酶标仪EnsightTM（Perkin EImer）在560nm处检测结晶紫吸光度。应用GraphPad Prism 7以及SPSS20.0分析数据。2.通过细胞铺展实验观察4.1B过表达组（4.1B-GFP）和对照组细胞（GFP-CON（4.1B-/-））的 MGC-803 细胞以及 4.1B 敲除组（4.1B KO）和对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））的MKN-45细胞随着4.1B蛋白表达水平的变化,胃癌细胞铺展速度的变化。应用Zeiss LSM880激光共聚焦扫描显微镜下观察,微管以氩离子激光（488 nm）激发,随机抽取200个细胞每组观察并用63X物镜拍照。细胞的铺展面积应用Image J分析,然后应用GraphPad Prism 7以及SPSS20.0分析数据。3.通过细胞划痕实验和transwell迁移实验观察4.1B过表达组（4.1B-GFP）和对照组细胞（GFP-CON（4.1B-/-））的MGC-803细胞以及4.1B敲除组（4.1B KO）和对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））的MKN-45细胞随着4.1B蛋白表达水平的变化,胃癌细胞在横向和纵向上的迁移能力的变化。应用Image J、GraphPad Prism 7以及.SPSS20.0分析数据4.通过细胞侵袭实验观察4.1B过表达组（4.1B-GFP）和对照组细胞（GFP-CON（4.1B-/-））的 MGC-803 细胞以及 4.1B 敲除组（4.1B KO）和对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））的MKN-45细胞随着4.1B蛋白表达水平的变化,胃癌细胞侵袭能力的变化。应用GraphPad Prism 7以及SPSS20.0分析数据。5.通过裸鼠尾静脉注射实验观察4.1B过表达组（4.1B-GFP）和对照组细胞（GFP-CON（4.1B-/-））的 MGC-803 细胞以及 4.1B 敲除组（4.1B KO）和对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））的MKN-45细胞随着4.1B蛋白表达水平的变化,胃癌细胞血行转移能力的变化。应用GraphPad Prism 7以及SPSS20.0分析数据6.提取4.1B过表达组（4.1B-GFP）和对照组细胞（GFP-CON（4.1B-/-））的MGC-803细胞以及4.1B敲除组（4.1B KO）和对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））的MKN-45细胞总蛋白通过western blotting技术观察EMT相关蛋白的表达情况。结果:1.细胞粘附实验结果显示:4.1B过表达会增加胃癌细胞MGC-803细胞的粘附速度和延展面积。而敲除MKN-45细胞中的4.1B蛋白后,MKN-45（4.1B KO）的粘附速度和延展面积均较对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））下降,差异有统计学意义。2.细胞迁移和侵袭实验结果显示:4.1B蛋白过表达能抑制胃癌细胞MGC-803细胞的迁移和侵袭能力。而敲除MKN-45细胞中的4.1B蛋白后,MKN-45（4.1B KO）的迁移和侵袭能力较对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））增加,差异有统计学意义。3.裸鼠尾静脉注射结果显示:4.1B过表达能抑制胃癌细胞MGC-803细胞血行转移瘤的形成。而敲除MKN-45细胞中的4.1B蛋白后,MKN-45（4.1B KO）的血行转移成瘤能力较对照组MKN-45（CON（4.1B+/+））增加,差异有统计学意义。4.Western blotting 结果显示 4.1B 蛋白能够上调 β-catenin、E-cadherin 的表达水平,同时会抑制与细胞外基质降解有关的MMP-2以及MMP-9的表达水平。结论:4.1B蛋白通过抑制EGFR/MAPK/ERK1/2和EGFR/PI3K/AKT信号通路的激活来抑制EMT的进程,从而抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。
尹晶晶[9]（2020）在《ILs基因SNPs与胃癌易感性关联及生物信息学功能研究》文中指出胃癌是发病率及致死率极高的一种恶性肿瘤,影响全世界人群的健康。中国作为全球胃癌高发区之一,每年因胃癌所致的健康及经济负担极大。多数胃癌早期不易发现,严重影响胃癌病人的治疗及预后,给病人带来极大的生理及精神痛苦。因此,研究胃癌的易感性是十分必要的。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）是一类重要的突变,很多基因的SNPs与胃癌易感性相关,可以作为胃癌易感性相关的生物标志物。炎症影响胃癌的发生、发展,而白细胞介素（白介素）,是一类炎症相关的重要细胞因子。研究表明白介素（Interleukin,IL）基因的SNPs对胃癌的易感性也会产生影响。虽然已经发现多种ILs基因的SNPs与胃癌易感性相关,但现有的关于ILs基因SNPs与胃癌易感性的研究结果间仍存在争议。目的通过meta分析的方法找出与胃癌易感性有关的ILs基因单核苷酸多态性位点,并对筛选出的SNPs在河南省汉族人群样本中进行实验,验证其与胃癌易感性的关系,最后通过生物信息学等方法初步探索与胃癌易感性相关位点突变对生物学功能可能产生的影响。方法（1）基于meta分析的方法定量评价ILs基因SNPs与胃癌易感性之间的关系,找出与胃癌易感性相关的SNPs:使用NoteExpress软件整理检索后获得的以中国汉族人群为实验对象、研究内容为ILs基因SNPs与胃癌易感性关系的研究,通过Review Manager 5.3软件对符合纳入标准的研究进行meta分析,通过获得不同遗传模型下（共显性、显性、隐性、超显性模型）两者关系的比值比（Odds ratio,OR）及其对应置信区间（95%CI）,找出四种模型下均与胃癌易感性相关的SNPs。（2）基因分型实验验证meta分析所得结果:在河南汉族人群中,对meta分析所得四种遗传模型下均与胃癌易感性相关的SNPs进行基因分型实验,检测是否与meta分析结果一致,并分析是否存在基因-环境交互作用。本研究依据病例-对照研究设计,对照组和病例组采用频数匹配的方式,对两组人群的性别及年龄（±2岁）进行匹配。样本量计算采用PASS 15.0软件,纳入胃癌病例和对照人群各660例。对meta分析结果确定的胃癌易感性相关SNPs,采用iMLDRTM多重SNP检测方法（Improved multiplex ligation detection reaction）在两组样本中进行基因分型实验。（3）对基因分型实验结果统计分析后得到的胃癌易感性相关SNPs,基于生物信息学,利用3dSNP以及VarCards在线分析网站,探索突变可能导致的生物学功能改变。（4）统计分析方法:基于SPSS 21.0软件,依据样本类型使用t检验或χ2验,分析病例及对照组间差异。拟合优度χ2检验用于检测各SNP在对照人群中是否满足Hardy-Weinberg平衡。不同SNPs与胃癌之间的易感性的关联分析基于logistic回归。PARP（Population attributable risk percentage）用于评价SNPs的公共卫生学意义。基因环境交互作用（SNPs与吸烟、饮酒等因素间）通过多因子降维法检验（MDR3.0软件）。结果（1）Meta分析所得不同遗传模型下与胃癌易感性有关的ILs基因及其SNP为:IL-1B基因rs1143627（隐性模型）,IL-1B基因rs16944（共显性、显性、隐性模型）,IL-6基因rs1800796（共显性模型）,IL-8基因rs4073（共显性、显性、隐性模型）,IL-10基因rs1800896（共显性、显性、隐性、超显性模型）,IL-1 7F基因rs763780（共显性、显性、隐性、超显性模型）。四种遗传模型下关联分析差异有统计学意义的rs1800896及rs763780进行后续基因分型实验。（2）分型实验统计分析结果显示IL-17Frs763780与胃癌易感性密切相关:调整后的logistic回归分析显示,共显性模型中rs763780 CT基因型、显性模型中（CT+CC）基因型以及超显性模型中CT基因型也都提高了胃癌的患病风险（OR=1.41,.95%CI:1.08-1.86;OR=1.41,95%CI:1.08-1.84;OR=1.40,95%CI:1.07-1.84）。rs763780 CT基因型在年龄≥60岁组人群中（OR=1.59,95%CI:1.06-2.38）、男性人群中（OR=1.44,95%CI:1.05-1.98）、不吸烟者（OR-1.43,95%CI:1.01-2.02）、饮酒人群（OR=1.96,95%CI:1.19-3.25）及无胃癌家族史者（OR=1.41,95%CI:1.07-1.85）中均提示为危险因素;rs763780显性模型中的突变基因型（CT+CC）,在年龄≥60岁组人群中（OR=1.54,95%CI:1.04-2.30）、男性人群中（OR=1.42,95%CI:1.04-1.94）、不吸烟者（OR=1.45,95%CI:1.03-2.04）、饮酒人群（OR=2.04,95%CI:1.24-3.35）及无胃癌家族史者（OR=1.40,95%CI:1.07-1.84）中均为危险因素,提示相应基因型携带者更有可能患胃癌。而IL-10 rs1800896实验结果经统计分析后显示其与胃癌易感性无关。（3）假阳性报告率分析结果显示,（CT/TT）或（CT+CC/TT）模型下,rs763780在全人群、年龄≥60岁、男性、非吸烟人群、饮酒者以及无胃癌家族史人群中的FPRP（False-positive report probability）值均小于预设值0.5,可以认为变异与胃癌易感性的关联有意义。（4）MDR分析基因-环境交互作用结果显示,具有吸烟、饮酒史且携带有rs763780 C等位基因的人群胃癌的发病风险,是不含有这三项的人群的2.37倍（OR=2.37,95%CI:1.86-3.01）。（5）利用在线分析网站3dSNP以及VarCards对rs763780所导致的生物功能的可能影响进行预测,结果显示:rs763780的变异在染色体层面对其相关联的基因间的相互关系产生影响,进而可能影响他们所调控的生物学功能,但对其所在基因编码的蛋白质功能等的影响程度较弱。结论（1）IL-17F rs763780（T>C）与胃癌易感性增加相关,而IL-10 rs1800896（T>C）暂未发现与胃癌易感性相关。（2）基因-环境交互作用分析结果显示,具有吸烟、饮酒史且携带有rs763780 C等位基因的人群胃癌的发病风险更高,即存在基因-环境交互作用。（3）rs763780的变异可能影响其在染色质环中相关基因间的相互作用关系,关于rs763780携带者胃癌易感性增加的具体生物学机制有待进一步研究。
蒋慧馨[10]（2020）在《基于Treg/Thl7研究半夏泻心汤调节Hp感染PLGC胃黏膜免疫微环境的作用机制》文中提出目的:基于Treg/Th17探讨半夏泻心汤对Hp感染PLGC小鼠根除Hp以及调节胃黏膜免疫微环境的效应机制,为中医药逆转PLGC提供一定的理论依据。方法:选取造模成功的Hp感染PLGC小鼠模型25只和正常组5只,分组为正常组、模型组、四联组、全方组、升清组、降浊组,各5只。用药干预方法:正常组、模型组以生理盐水10ml/kg/d灌胃6周,自由饮食饮水;四联组以四联杀菌药10ml/kg/d灌胃2周,之后自由饮食饮水。全方组、升清组、降浊组分别以半夏泻心汤、升清汤、降浊汤10ml/kg/d灌胃6周,自由饮食饮水。检测方法:药物干预结束后处死小鼠,取血液、全胃,通过HE染色和Giemsa染色进行Hp计数、观察胃黏膜病理组织学改变,通过双抗体夹心酶标免疫法（Elisa）检测小鼠血清和胃组织匀浆液中细胞因子TGF-β、IL-6、IL-17A的浓度,通过蛋白印迹法（Western Blot）检测胃组织中Fox P3、RORγt蛋白表达水平。结果:1、在根除Hp方面:与模型组比相比,四联组有效根除Hp的功效（P<0.05）,全方组、升清组、降浊组与模型组比较无统计学差异（P>0.05）,全方组、升清组、降浊组组间无统计学差异（P>0.05）,在数值上均有根除Hp的趋势,且全方组优于升清组和降浊组。2、在改善胃黏膜组织病理方面:半夏泻心汤全方效果最佳。与模型组对比,全方组和升清组显着改善胃黏膜慢性炎症性反应（P<0.01）,且全方组与升清组之间无统计学差异（P>0.05）。模型组与四联组、降浊组比较无统计学差异（P>0.05）,在数值上四联组和降浊组也有改善慢性炎症性反应的趋势。与模型组对比,四组均能显着改善胃黏膜炎症活动性（P<0.01）,四组组间无差异（P>0.05）,在数值上半夏泻心汤及其拆方改善的程度更明显。与模型组对比,四组在改善胃黏膜萎缩和PLGC方面无统计学差异（P>0.05）,四组组间比较也无统计学差异（P>0.05）,在数值上均有改善的趋势,且半夏泻心汤全方功效最佳。3、在分子作用机制中,四联组、全方组、升清组、降浊组四组均可降低TGF-β、IL-6、IL-17A的浓度以及降低Fox P3、RORγt的表达水平（P<0.05）。全方组有优于拆方组的趋势。免疫抑制Treg中:血清中TGF-β的浓度:与模型组比较,四组均显着降低血清中TGF-β浓度（P<0.01）。四组间无统计学差异（P>0.05）,在数值上比较,四联组有优于其他三组的趋势,其次为升清组、全方组、降浊组。胃组织匀浆液中TGF-β的浓度:与模型组比较,四组均显着降低胃组织匀浆中TGF-β浓度（P<0.01）。与升清组相比,四联组显着降低胃组织匀浆中TGF-β浓度（P<0.01）,与全方组相比,四联组有效降低胃组织匀浆中TGF-β浓度（P<0.05）。全方组、升清组、降浊组组间无统计学差异（P>0.05）,在数值上比较,降浊组有优于全方组和升清组的趋势,其次为全方组、升清组。Fox P3蛋白表达水平:与模型组比较,四联组、全方组、升清组均显着降低Fox P3蛋白表达水平（P<0.01）,降浊组有效降低Fox P3蛋白表达水平（P<0.05）。与降浊组比较,四联组有效降低Fox P3蛋白表达水平（P<0.05）;四联组、全方组、升清组组间无统计学差异（P>0.05）;全方组、升清组与降浊组之间无统计学差异（P>0.05）;在数值上比较,四联组降低Fox P3蛋白表达水平最好,其次为全方组、升清组、降浊组。免疫反应Th17中:血清中IL-6的浓度:与模型组比较,四组均显着降低血清中IL-6浓度（P<0.01）。与升清组比较,四联组显着降低血清中IL-6浓度（P<0.01）;与全方组、降浊组比较,四联组有效降低血清中IL-6浓度（P<0.05）。全方组、升清组、降浊组组间无统计学差异（P>0.05）,在数值上比较,降浊组有优于全方组和升清组的趋势,其次为全方组、升清组。胃组织浆液中IL-6的浓度:与模型组比较,四组均显着降低胃组织浆液中IL-6浓度（P<0.01）。与升清组、降浊组相比,四联组有效降低胃组织浆液中IL-6浓度（P<0.05）。全方组、升清组、降浊组组间无统计学差异（P>0.05）,在数值上比较,全方组有优于升清组和降浊组的趋势。RORγt蛋白表达水平:与模型组相比,四联组、全方组均显着降低RORγt蛋白表达水平（P<0.01）,升清组、降浊组均有效降低RORγt蛋白表达水平（P<0.05）。四组组间无统计学差异（P>0.05）,在数值上比较,全方组有优于其他三组的趋势,其次为四联组、升清组、降浊组。血清中IL-17A的浓度:与模型组比较,四组均显着降低血清中IL-17A浓度（P<0.01）,四组组间无统计学差异（P>0.05）,在数值上比较,降浊组有优于其他三组的趋势,其次为四联组、全方组、升清组。胃组织匀浆中IL-17A的浓度:与模型组比较,四联组、全方组、升清组均显着降低胃组织匀浆中IL-17A浓度（P<0.01）,降浊组有效降低胃组织匀浆中IL-17A浓度（P<0.05）。与升清组、降浊组比较,四联组显着降低胃组织匀浆中IL-17A浓度（P<0.01）,与全方组比较,四联组有效降低胃组织匀浆中IL-17A浓度（P<0.05）。全方组、升清组、降浊组组间无统计学差异（P>0.05）,在数值上比较,全方组有优于升清组和降浊组的趋势。结论:半夏泻心汤能通过升清降浊有效根除Hp、一定程度上改善胃黏膜组织病理以及调节胃黏膜免疫平衡,减轻炎症反应,在“菌-炎-癌”致病途径中,对延缓PLGC进程具有一定的意义。
二、幽门螺杆菌诱导MKN 45细胞分泌IL-8及其与p38信号转导途径的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、幽门螺杆菌诱导MKN 45细胞分泌IL-8及其与p38信号转导途径的关系（论文提纲范文）
（1）致瘤微生物HPV和H.pylori调控mTOR信号通路介导恶性转化的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 HPV-16 E7上调miR-106a靶向LKB1激活mTOR信号通路调控宫颈鳞癌细胞的异常增殖与自噬 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 补充附图 |
| 第一部分小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 H.pylori通过NF-κB上调MYADM激活mTOR信号通路介导胃恶性转化 |
| 前目 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分小结 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| Western blot原始数据 |
（2）TAK1稳定YAP在胃癌干细胞自我更新和肿瘤发生中的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 胃癌 |
| 1.2 肿瘤干细胞 |
| 1.3 转化生长因子-β活化激酶1 |
| 1.4 Hippo信号通路 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 临床组织样本 |
| 2.2 质粒的构建与扩增 |
| 2.3 细胞培养和转染 |
| 2.4 RNA提取和实时定量PCR(q PCR) |
| 2.5 蛋白质印迹分析 |
| 2.6 免疫组织化学(IHC)染色 |
| 2.7 细胞增殖,迁移和侵袭实验 |
| 2.8 干细胞微球形成试验 |
| 2.9 细胞流式分析 |
| 2.10 TAK1和YAP蛋白的结合方式 |
| 2.11 胃癌细胞系和肿瘤相关成纤维细胞(CAF)的共培养 |
| 2.12 体内实验 |
| 2.13 苏木精伊红(HE)染色 |
| 2.14 免疫共沉淀(Co-IP)和质谱(MS)分析 |
| 2.15 免疫荧光 |
| 2.16 荧光素酶报告基因 |
| 2.17 细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定 |
| 2.18 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TAK1 在胃癌中上调 |
| 3.2 TAK1 对胃癌恶性表型的促进作用 |
| 3.3 TAK1 在胃癌干细胞中高表达 |
| 3.4 TAK1 独立于其激酶活性稳定YAP |
| 3.5 TAK1/ YAP轴促进了胃癌干细胞中SOX2和SOX9 的转录 |
| 3.6 IL-6 促进胃癌中TAK1 表达的增加 |
| 3.7 TAK1 抑制胃癌细胞的化疗敏感性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 TAK1在肿瘤中的生物学作用研究进展 |
| 参考文献 |
（3）DUSP14在胃癌中的临床意义及通过EMT促进侵袭转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 胃癌生物标志物的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）EBV相关胃癌细胞中EBV通过TRAF2和ERK信号通路下调COX-2的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 所用仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要使用仪器 |
| 1.2 主要使用试剂和耗材 |
| 1.3 使用的试剂配制 |
| 2 选择细胞系 |
| 3 细胞处理 |
| 3.1 细胞的复苏 |
| 3.2 细胞的传代 |
| 4 PTGS2基因启动子部分区域甲基化检测 |
| 4.1 细胞系DNA的提取 |
| 4.2 亚硫酸氢盐基因组测序(BGS) |
| 5 PTGS2 基因m RNA检测 |
| 5.1 细胞系总RNA的提取 |
| 5.2 反转录为cDNA |
| 5.3 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR) |
| 5.4 qRT-PCR结果数据分析 |
| 6 胃癌细胞系中相关蛋白表达的检测 |
| 6.1 蛋白提取 |
| 6.2 Western blotting测蛋白表达 |
| 7 microRNA的qRT-PCR检测 |
| 8 细胞免疫荧光检测 |
| 9 LMP1和LMP2A过表达细胞模型建立 |
| 9.1 质粒的预备 |
| 9.2 重组质粒转染胃癌细胞系SGC7901 |
| 10 siRNA转染 |
| 11 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 Real-time PCR检测胃癌细胞系中COX-2 的转录表达 |
| 2 Western blotting检测胃癌细胞系中COX-2 蛋白表达 |
| 3 COX-2编码基因启动子区域甲基化状态检测 |
| 4 COX-2 相关3种micro RNA的检测结果 |
| 5 COX-2蛋白在胃癌细胞系中的亚细胞定位检测 |
| 6 外源性EBV潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A稳定表达对COX-2 的影响 |
| 6.1 外源性LMP1和LMP2A稳定表达SGC7901 细胞的筛选和建立 |
| 6.2 外源性LMP1和LMP2A稳定过表达对COX-2 的影响 |
| 7 外源性LMP1或LMP2A瞬时表达对COX-2 的影响 |
| 7.1 建立外源性LMP1和LMP2A瞬时过表达的SGC7901 细胞 |
| 7.2 外源性LMP1和LMP2A瞬时表达对COX-2 的影响 |
| 8 干扰LMP1和LMP2A的表达对COX-2 的影响 |
| 9 Western blotting检测TRAF2 在胃癌细胞系中的表达 |
| 10 外源性LMP1和LMP2A表达对TRAF2 的影响 |
| 10.1 外源性LMP1和LMP2A稳定表达对TRAF2 的影响 |
| 10.2 外源性LMP1和LMP2A瞬时表达对TRAF2 的影响 |
| 11 干扰LMP1和LMP2A表达对TRAF2 的影响 |
| 12 靶向干扰TRAF2对COX-2 表达的影响 |
| 13 Western blotting检测ERK信号分子在胃癌细胞系中的表达 |
| 14 过表达LMP1 后对p-ERK的影响 |
| 15 阻断ERK通路对COX-2 的影响 |
| 15.1 MEK抑制剂PD0325901 阻断ERK通路 |
| 15.2 小干扰序列阻断ERK通路 |
| 16 阻断AKT通路对COX-2 表达的影响 |
| 16.1 LY294002 阻断PI3K/AKT通路 |
| 16.2 干扰Fox O1对COX-2 的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（5）CXCL8/FAK信号通路在胃癌细胞增殖、迁移及EMT中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 胃癌 |
| 1.1 胃癌的现状 |
| 1.2 胃癌的发病机制 |
| 2 肿瘤微环境 |
| 2.1 肿瘤微环境相关细胞 |
| 2.1.1 间充质基质细胞 |
| 2.1.2 肿瘤相关巨噬细胞 |
| 2.1.3 肿瘤相关成纤维细胞 |
| 2.2 肿瘤炎性微环境 |
| 3 CXCL8 |
| 3.1 CXCL8的概述 |
| 3.2 CXCL8的受体 |
| 3.3 CXCL8的功能 |
| 3.4 CXCL8与胃癌 |
| 4 FAK |
| 4.1 FAK的结构与功能 |
| 4.2 FAK与肿瘤 |
| 4.3 FAK与胃癌 |
| 第二章 CXCL8/FAK信号通路在胃癌细胞增殖、迁移及EMT中的作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3.1 细胞培养相关主要试剂 |
| 2.1.3.2 转录组测序相关试剂耗材 |
| 2.1.3.3 实时定量PCR相关主要试剂耗材 |
| 2.1.3.4 ELISA主要相关试剂盒 |
| 2.1.3.5 Western blot相关试剂耗材 |
| 2.1.3.6 细胞增殖相关试剂耗材 |
| 2.1.3.7 细胞迁移相关试剂耗材 |
| 2.1.4 主要耗材和仪器及厂家 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 转录组测序及验证 |
| 3.2.1 转录组测序流程 |
| 3.2.2 qPCR验证 |
| 3.2.2.1 引物设计 |
| 3.2.2.2 提取细胞RNA |
| 3.2.2.3 RNA反转录为c DNA |
| 3.2.2.4 qPCR |
| 3.2.3 ELISA验证 |
| 3.2.4 FAK功能缺失抑制CXCL8 的表达 |
| 3.2.4.1 FAK小分子抑制剂TAE226 处理胃癌细胞 |
| 3.2.4.2 qPCR检测CXCL8 的表达 |
| 3.2.4.3 Western blot检测CXCL8 的表达 |
| 3.2.4.3.1 提取细胞蛋白 |
| 3.2.4.3.2 蛋白浓度测定 |
| 3.2.4.3.3 Western blot |
| 3.2.5 FAK过表达增加CXCL8 的表达 |
| 3.2.5.1 FAK过表达载体的质粒提取 |
| 3.2.5.2 FAK过表达载体转染MKN45 细胞 |
| 3.2.5.3 qPCR检测FAK及 CXCL8 的表达 |
| 3.2.5.4 ELISA检测CXCL8 的表达 |
| 3.3 CXCL8 促进胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和EMT |
| 3.3.1 胃癌细胞中CXCL8及受体的表达检测 |
| 3.3.2 细胞增殖实验 |
| 3.3.2.1 MTT法 |
| 3.3.2.2 台盼蓝法 |
| 3.3.2.3 CCK8法 |
| 3.3.3 克隆形成实验 |
| 3.3.4 细胞迁移实验 |
| 3.3.4.1 Transwell实验 |
| 3.3.4.2 划痕实验 |
| 3.3.5 EMT检测实验 |
| 3.4 CXCL8 通过激活FAK通路促进胃癌细胞的增殖、迁移和EMT |
| 3.4.1 检测CXCL8 对胃癌细胞中FAK通路的激活 |
| 3.4.2 检测FAK功能缺失情况下CXCL8 对胃癌细胞增殖的影响 |
| 3.4.3 检测FAK功能缺失情况下CXCL8 对胃癌细胞迁移的影响 |
| 3.4.4 检测FAK功能缺失情况下CXCL8 对胃癌细胞EMT的影响 |
| 3.5 统计学方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 MKN45 细胞与FAK基因敲除细胞转录组结果分析 |
| 4.1.1 转录组测序结果分析 |
| 4.1.1.1 DEG筛选及分析 |
| 4.1.1.2 GO功能分析 |
| 4.1.1.3 KEGG通路分析 |
| 4.1.1.4 信号通路分析 |
| 4.2 转录组结果验证 |
| 4.2.1 FAK基因敲除抑制胃癌细胞CXCL8 的表达 |
| 4.2.1.1 FAK基因敲除降低CXCL8的m RNA表达水平 |
| 4.2.1.2 FAK的缺失导致CXCL8 分泌减少 |
| 4.2.2 TAE226 处理细胞抑制CXCL8 的表达 |
| 4.2.2.1 TAE226 处理抑制胃癌细胞CXCL8的mRNA水平 |
| 4.2.2.2 Western blot检测TAE226 抑制胃癌细胞CXCL8 的表达 |
| 4.2.3 过表达FAK促进CXCL8 的表达 |
| 4.2.3.1 胃癌细胞中过表达FAK |
| 4.2.3.2 过表达FAK促进CXCL8 的表达 |
| 4.3 CXCL8 促进胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和EMT |
| 4.3.1 三种胃癌细胞中表达CXCL8受体 |
| 4.3.2 CXCL8证明促进胃癌细胞的增殖 |
| 4.3.2.1 MTT法检测证明CXCL8 促进细胞增殖 |
| 4.3.2.2 台盼蓝法检测证明CXCL8促进细胞增殖 |
| 4.3.2.3 CCK8 法检测证明CXCL8 促进细胞增殖 |
| 4.3.3 CXCL8促进胃癌细胞的克隆形成能力 |
| 4.3.4 CXCL8促进胃癌细胞的迁移 |
| 4.3.4.1 CXCL8 促进MKN45 细胞的迁移 |
| 4.3.4.2 CXCL8 促进NUGC3和NCIN87 细胞的迁移 |
| 4.3.5 CXCL8 促进胃癌细胞EMT的发生 |
| 4.3.5.1 CXCL8 促进胃癌细胞EMT发生的形态学变化 |
| 4.3.5.2 Western blot检测证明CXCL8 促进胃癌细胞EMT |
| 4.4 CXCL8 激活FAK通路促进胃癌细胞的增殖、迁移和EMT |
| 4.4.1 CXCL8 激活FAK通路 |
| 4.4.2 抑制FAK活性减弱CXCL8 对胃癌细胞增殖的促进作用 |
| 4.4.3 抑制FAK活性减弱CXCL8 对胃癌细胞迁移的促进作用 |
| 4.4.4 抑制FAK活性减弱CXCL8 对胃癌细胞EMT的促进作用 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
（6）紫云英苷诱导人胃癌细胞凋亡、周期阻滞及迁移抑制作用的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 胃癌概述 |
| 1.1.1 胃癌的研究进展 |
| 1.1.2 胃癌的致病因素 |
| 1.1.2.1 幽门螺旋杆菌 |
| 1.1.2.2 高盐摄入 |
| 1.1.2.3 吸烟 |
| 1.1.2.4 酒精 |
| 1.1.2.5 胃癌家族遗传病史 |
| 1.1.3 胃癌的诊断手段 |
| 1.1.3.1 内窥镜评估 |
| 1.1.3.2 病理评估 |
| 1.1.3.3 血清胃蛋白酶原测试 |
| 1.1.3.4 血清幽门螺杆菌检测 |
| 1.1.3.5 三叶因子3 |
| 1.1.4 胃癌的临床治疗 |
| 1.1.4.1 手术治疗 |
| 1.1.4.2 化学治疗 |
| 1.1.4.3 放射治疗 |
| 1.1.4.4 分子靶向治疗 |
| 1.2 紫云英苷的研究进展 |
| 1.2.1 抗菌作用 |
| 1.2.2 抗炎作用 |
| 1.2.3 抗病毒作用 |
| 1.2.4 抗肿瘤作用 |
| 1.3 细胞凋亡及相关途径 |
| 1.3.1 细胞凋亡 |
| 1.3.2 相关信号通路 |
| 1.3.2.1 活性氧 |
| 1.3.2.2 MAPK信号通路 |
| 1.3.2.3 NF-κB信号通路 |
| 1.4 细胞周期及相关途径 |
| 1.4.1 细胞周期 |
| 1.4.2 相关信号通路 |
| 1.4.2.1 Akt信号通路 |
| 1.4.2.2 p53信号通路 |
| 1.4.2.3 STAT3信号通路 |
| 1.5 细胞迁移及相关途径 |
| 1.5.1 细胞迁移 |
| 1.5.2 相关信号通路 |
| 1.5.2.1 TGF-β信号通路 |
| 1.5.2.2 上皮-间质转化 |
| 1.6 目的及意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胃癌细胞的复苏 |
| 2.2.2 胃癌细胞培养和扩增 |
| 2.2.3 CCK-8法检测细胞存活率 |
| 2.2.4 Hoechst/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 2.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 流式细胞术检测线粒体膜电位 |
| 2.2.7 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.2.8 流式细胞术检测细胞内活性氧的水平 |
| 2.2.9 细胞划痕实验 |
| 2.2.10 蛋白质免疫印迹法检测蛋白质表达量变化 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 紫云英苷对胃癌细胞的杀伤作用及正常细胞的毒副作用 |
| 3.2 紫云英苷诱导胃癌细胞发生线粒体依赖性凋亡 |
| 3.2.1 荧光显微镜观察胃癌AGS细胞荧光强度及形态学变化 |
| 3.2.2 流式细胞术检测胃癌AGS细胞的凋亡率 |
| 3.2.3 流式细胞术检测胃癌AGS细胞线粒体膜电位 |
| 3.2.4 蛋白质免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白表达水平 |
| 3.3 紫云英苷调控MAPK及NF-κB信号通路诱导胃癌细胞凋亡 |
| 3.4 紫云英苷诱导胃癌AGS细胞发生G2/M期周期阻滞 |
| 3.4.1 流式细胞术检测胃癌AGS细胞周期分布 |
| 3.4.2 蛋白质免疫印迹法检测细胞周期相关蛋白表达水平 |
| 3.5 紫云英苷调控Akt、p53及STAT3信号通路诱导胃癌细胞的周期阻滞 |
| 3.6 紫云英苷对胃癌AGS细胞的迁移抑制作用 |
| 3.6.1 细胞划痕实验检测胃癌AGS细胞的迁移率 |
| 3.6.2 蛋白质免疫印迹法检测细胞迁移相关蛋白表达水平 |
| 3.7 紫云英苷对胃癌AGS细胞内活性氧水平的调控作用 |
| 3.8 紫云英苷通过调控ROS介导胃癌AGS细胞的凋亡 |
| 3.9 紫云英苷通过调控ROS介导胃癌AGS细胞的周期阻滞 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）黄豆黄素诱导人胃癌AGS细胞凋亡机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 胃癌的研究进展 |
| 1.2 胃癌的发病机制 |
| 1.2.1 家族遗传因素 |
| 1.2.2 性别因素 |
| 1.2.3 幽门螺杆菌 |
| 1.2.4 生活方式及饮食因素 |
| 1.2.5 癌前病变 |
| 1.3 胃癌的治疗方法 |
| 1.3.1 手术治疗 |
| 1.3.2 化学治疗 |
| 1.3.3 放射治疗 |
| 1.3.4 生物免疫治疗 |
| 1.3.5 分子靶向治疗 |
| 1.4 细胞凋亡及相关信号转导通路 |
| 1.4.1 细胞凋亡 |
| 1.4.2 活性氧簇 |
| 1.4.3 Mitogen-activated protein kinases (MAPK)信号通路 |
| 1.4.4 Signal transducer and activator of transcription (STAT3)信号通路 |
| 1.4.5 Nuclear factorκB (NF-κB)信号通路 |
| 1.5 大豆异黄酮研究进展 |
| 1.5.1 机体内化学动力学 |
| 1.5.2 抗骨质疏松,预防骨坏死 |
| 1.5.3 降血脂降血糖 |
| 1.5.4 抗肿瘤作用 |
| 1.5.5 类雌激素和抗雌激素活性 |
| 1.6 目的及意义 |
| 1.7 实验技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验细胞系及黄豆黄素标品 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 细胞的传代培养及体外扩增 |
| 2.3 CCK-8 比色法 |
| 2.4 Hoechst33342 染色法 |
| 2.5 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法 |
| 2.6 线粒体膜电位检测法 |
| 2.7 DCFH-DA活性氧检测 |
| 2.8 蛋白质免疫印迹法 |
| 2.9 统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 黄豆黄素对人胃癌细胞的杀伤作用及对人正常细胞的毒副作用 |
| 3.2 黄豆黄素对人胃癌AGS细胞的诱导线粒体依赖凋亡作用 |
| 3.2.1 Hoechst33342/PI染色法检测细胞凋亡情况 |
| 3.2.2 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况 |
| 3.2.3 JC-1 荧光探针法检测细胞线粒体膜电位变化 |
| 3.2.4 Western blotting法检测参与细胞凋亡调控蛋白表达量变化 |
| 3.3 黄豆黄素对人胃癌AGS细胞周期调控机制 |
| 3.4 黄豆黄素对人胃癌AGS细胞内MAPK/NF-κB/STAT3 凋亡相关信号通路的调控机制 |
| 3.5 黄豆黄素对人胃癌AGS细胞内活性氧(ROS)水平的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（8）4.1B蛋白对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 4.1B蛋白在胃癌患者胃黏膜的表达及与患者预后之间的关系 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 4.1B蛋白在胃癌细胞中的表达及与细胞增殖的关系 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 4.1B蛋白抑制肿瘤细胞增殖的机制 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 4.1B蛋白对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响及机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述: 4.1B蛋白的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及在校期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）ILs基因SNPs与胃癌易感性关联及生物信息学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 ILs基因SNPs与胃癌易感性关联研究的meta分析 |
| 2.1.1 文献检索与收集 |
| 2.1.2 文献纳入 |
| 2.1.3 文献资料分析、质量评价 |
| 2.1.4 统计学分析 |
| 2.2 生物学实验 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 溶液的配制 |
| 2.2.4 研究方法 |
| 2.2.5 统计学分析 |
| 2.3 基因分型实验验证后胃癌易感性相关SNPs的生物学功能初探 |
| 3 结果 |
| 3.1 ILs基因SNPs与胃癌易感性关联的meta分析 |
| 3.1.1 文献检索结果 |
| 3.1.2 ILs基因SNPs及相应文献的基本信息 |
| 3.1.3 Meta分析结果 |
| 3.1.4 敏感性分析 |
| 3.1.5 发表偏倚分析 |
| 3.2 基因分型实验结果分析 |
| 3.2.1 研究对象一般特征 |
| 3.2.2 SNPs的分型结果 |
| 3.2.3 Hardy-Weinberg平衡检验 |
| 3.2.4 两个SNPs和胃癌遗传易感性的关系 |
| 3.2.5 两个SNPs与胃癌遗传易感性的分层分析 |
| 3.2.6 假阳性报告率分析及人群归因危险度百分比评估 |
| 3.2.7 基因环境交互作用 |
| 3.3 rs763780的生物学功能初探 |
| 3.3.1 rs763780三维染色质环作用关系 |
| 3.3.2 rs763780所致蛋白质功能影响预测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 本研究概述 |
| 4.2 ILs基因单核苷酸多态性与胃癌的关系 |
| 4.3 基因-环境交互作用对胃癌的影响 |
| 4.4 基于生物信息学的rs763780生物学功能初探 |
| 4.5 本研究优点及局限性 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 白细胞介素:胃癌相关信号通路的重要调控因子 |
| 1 白细胞介素简介 |
| 2 白细胞介素与常见恶性肿瘤的关系 |
| 3 常见胃癌相关信号通路 |
| 4 白细胞介素参与影响胃癌发生、发展等过程的信号通路 |
| 参考文献 |
| 个人简历及学术论文发表情况 |
| 致谢 |
（10）基于Treg/Thl7研究半夏泻心汤调节Hp感染PLGC胃黏膜免疫微环境的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验主要药物 |
| 2 方法 |
| 2.1 给药方法 |
| 2.2 标本提取与处理 |
| 2.3 检测指标 |
| 2.3.1 整体行为学 |
| 2.3.2 微观形态学 |
| 2.3.3 分子生物学 |
| 2.4 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 整体行为学 |
| 2 微观形态学 |
| 2.1 观察胃黏膜外观形态 |
| 2.2 胃黏膜组织病理学检测 |
| 3 分子生物学 |
| 3.1 免疫抑制相关分子 |
| 3.2 免疫反应相关分子 |
| 讨论 |
| 1 现代医学对Hp感染PLGC的认识 |
| 1.1 Hp感染PLGC的发病机制及本实验检测指标选择 |
| 1.2 Hp感染PLGC的治疗方法 |
| 2 祖国医学对Hp感染PLGC认识 |
| 2.1 病因病机 |
| 2.2 半夏泻心汤及其拆方与Hp感染PLGC |
| 3 半夏泻心汤治疗Hp感染PLGC实验室疗效评价 |
| 3.1 改善整体行为一般情况 |
| 3.2 根除Hp方面 |
| 3.3 胃黏膜及病理组织变化 |
| 3.4 相关因子检测及讨论 |
| 4 实验不足与改进 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 半夏泻心汤干预“菌-炎-癌”致病过程中作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、幽门螺杆菌诱导MKN 45细胞分泌IL-8及其与p38信号转导途径的关系（论文参考文献）
- [1]致瘤微生物HPV和H.pylori调控mTOR信号通路介导恶性转化的机制[D]. 崔秀杰. 山东大学, 2021(10)
- [2]TAK1稳定YAP在胃癌干细胞自我更新和肿瘤发生中的机制研究[D]. 王刚. 安徽医科大学, 2021(01)
- [3]DUSP14在胃癌中的临床意义及通过EMT促进侵袭转移的机制研究[D]. 程修强. 新乡医学院, 2020(06)
- [4]EBV相关胃癌细胞中EBV通过TRAF2和ERK信号通路下调COX-2的研究[D]. 祁一凡. 青岛大学, 2020(01)
- [5]CXCL8/FAK信号通路在胃癌细胞增殖、迁移及EMT中的作用[D]. 马玉泽. 内蒙古大学, 2020(01)
- [6]紫云英苷诱导人胃癌细胞凋亡、周期阻滞及迁移抑制作用的分子机制研究[D]. 张翼. 黑龙江八一农垦大学, 2020(01)
- [7]黄豆黄素诱导人胃癌AGS细胞凋亡机制的研究[D]. 冯艳钰. 黑龙江八一农垦大学, 2020(09)
- [8]4.1B蛋白对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究[D]. 薛福敏. 郑州大学, 2020(02)
- [9]ILs基因SNPs与胃癌易感性关联及生物信息学功能研究[D]. 尹晶晶. 郑州大学, 2020(02)
- [10]基于Treg/Thl7研究半夏泻心汤调节Hp感染PLGC胃黏膜免疫微环境的作用机制[D]. 蒋慧馨. 天津中医药大学, 2020(04)